RNA测序主要用于帮助科学家研究细胞中基因的表达。这是由于信使RNA（mRNA）是由DNA基因产生的，而该信息可用于识别原始基因序列，所以，我们可以通过测量RNA的浓度，来测量这些细胞中成千上万基因的活性，这也被成为转录组。 RNA测序面临的第一个挑战是如何从混合群体中捕获特定细胞的mRNA，在我们体内，各种各样的细胞混合在一起，而且难以区分，这使得我们的测量结果会因为样本本身的异质性而大打折扣。为此，科学家们开发了‘单细胞RNA测序’（scRNA-seq）来解决这个问题，它为基础和生物医学研究，甚至药物开发提供了前所未有的洞察力。 RNA测序面临的第二个问题是RNA在体内的水平处于一种动态平衡的变化中，如果我们需要进行测序，必须先破坏（杀死）细胞，提取RNA后，再对其进行测序，这种做法一方面只能反应细胞的一个瞬时状态，另一方面，杀死细胞的这个过程也会导至RNA本身的水平发生变化，削弱了测得值和细胞本身状态之间的联系。 现在，EPFL的Bart Deplancke教授和苏黎世联邦理工学院的Julia Vorholt教授小组的科学家已经解决了这个问题。
由Wanze Chen博士（EPFL）和Orane Guillaume Gentil博士（ETH Zurich）领导的研究人员提出了一种新的微创技术，能在提取过程中保持细胞的活力，从而能够对成千上万基因在不同时间的活动进行跟踪，这种突破性的方法被称为Live-seq，这项工作发表于《Nature》上。 Live-seq的关键是一种被称为‘流体力显微镜’或FluidFM的显微镜技术，它使用比人类头发还细的微观通道，在苏黎世联邦理工学院几年前开发的显微镜下操纵样品中的微小体积的液体（飞托利特）。正因为如此，FluidFM允许用户将物质插入单个细胞，或从单个细胞中提取细胞质，包括mRNA，而不必杀死它们。
图1 | Live-seq将优化的基于FluidFM的活体细胞活检与增强的Smart-seq2 RNA-seq相结合。 （a）使用FluidFM的活体细胞取样程序的插图和代表图像（这里，应用于棕色前脂肪细胞IBA细胞）。白色箭头表示应用欠压或过压。黑色箭头表示探针中的缓冲液和提取物的量。 （b）根据每个面板上面列出的参数，对应用于IBA细胞的Live-seq进行质量控制。n = 10个细胞。nGene，检测到的基因数量；nCount，所有基因的总计数；百分比MT，线粒体基因的计数百分比。误差条代表平均值±s.d。 当研究人员设法从这些极少量的细胞质样本中保存并读出mRNA（转录组）时，导至Live-seq的关键进展出现了。因此，Live-seq现在可以将一个细胞在特定时间的转录组与它后来的分子或表型行为联系起来，即监测一个细胞中成千上万个基因在不连续的时间点上的活动，科学家将其称之为‘时间性’转录组分析。 Deplancke教授说：“有了Live-seq，我们现在可以独特地解决非常有趣和与生物医学相关的问题，例如为什么某些细胞分化而姐妹细胞不分化，或者为什么某些细胞对一种癌症药物有抵抗力，而它们的姐妹细胞又没有。”
图2 | Live-seq能够对细胞类型和状态（治疗）进行分层。 （a）实验设置。RAW_LPS和RAW_Mock分别使用100nM LPS或PBS。用一种化学鸡尾酒来区分ASPCs（方法）。ASPC_Pre和ASPC_Post表示ASPCs在诱导脂肪生成之前和之后（2天）的分化。 （b）按细胞类型/状态划分的活体基因组数据的t-SNE投影。ASPC_Pre的n = 61，ASPC_Post的n = 37，IBA的n = 44，RAW_Mock的n = 102，RAW_LPS的n = 50。 （c）scRNA-seq数据（Smart-seq2）的t-SNE投影，按细胞类型或状态着色。ASPC_Pre的n=60，ASPC_Post的n=35，IBA的n=153，RAW_Mock的n=157，RAW_LPS的n=149。 （d）scRNA-seq和Live-seq的所有细胞之间的基因表达相关性（Pearson's r）。 （e）从Live-seq和scRNA-seq数据中得出的对折基因表达变化的直接比较，当把对应于焦点细胞状态的细胞群（这里，左边是RAW_Mock，左边是RAW_LPS）与所有细胞的其余部分进行比较时（方法）。对于相关性，所有条件（所有基因、DE scRNA-seq和DE两者）的P = 2.2 × 10-16，双侧F检验。 （f, g）基于锚的数据整合后的Live-seq和scRNA-seq数据的可视化（方法）显示没有明显的分子差异。根据细胞类型和状态（治疗）（f）和方法（g）的整合Live-seq和scRNA-seq数据的t-SNE投影。
研究人员在测试Live-seq时表明，它可以准确地识别（‘分层’）不同的细胞类型和状态，而不会引入重大干扰。作为一个概念验证，他们使用他们的新平台直接绘制了个别免疫细胞（巨噬细胞）在变得活跃之前和之后的‘轨迹’，以及脂肪基质细胞（一种干细胞）在分化成脂肪细胞之前和之后的‘轨迹’。最后，该团队使用Live-seq作为‘转录组记录仪’，这使他们能够预测免疫细胞对免疫挑战的反应有多强或多弱。
图3 | 活体扫描引起的表达变化很少。 （a）实验设置。RAW_LPS和RAW_Mock分别使用100nM LPS或PBS。使用化学鸡尾酒来区分ASPCs（方法）。ASPC_Pre和ASPC_Post表示ASPCs在诱导脂肪生成之前和之后（2天）的分化。 （b）按细胞类型/状态划分的活体基因组数据的t-SNE投影。ASPC_Pre的n = 61，ASPC_Post的n = 37，IBA的n = 44，RAW_Mock的n = 102，RAW_LPS的n = 50。 （c）scRNA-seq数据（Smart-seq2）的t-SNE投影，按细胞类型或状态着色。ASPC_Pre的n=60，ASPC_Post的n=35，IBA的n=153，RAW_Mock的n=157，RAW_LPS的n=149。 （d）scRNA-seq和Live-seq的所有细胞之间的基因表达相关性（Pearson's r）。 （e）从Live-seq和scRNA-seq数据中得出的对折基因表达变化的直接比较，当把对应于焦点细胞状态的细胞群（这里，左边是RAW_Mock，左边是RAW_LPS）与所有细胞的其余部分进行比较时（方法）。对于相关性，所有条件（所有基因、DE scRNA-seq和DE两者）的P = 2.2 × 10-16，双侧F检验。 （f, g）基于锚的数据整合后的Live-seq和scRNA-seq数据的可视化（方法）显示没有明显的分子差异。根据细胞类型和状态（治疗）（f）和方法（g）的整合Live-seq和scRNA-seq数据的t-SNE投影。 在对比研究中，科学家们也发现Live-seq能够对细胞转录组进行分析，但不会对细胞的基本特性（如活力、生长或转录组）造成重大干扰。这反过来又开辟了一条新途径，将细胞状态直接与其当前和未来的分子和表型特性联系起来，为直接绘制细胞轨迹或记录预测细胞下游表型的分子事件铺平了道路。 通过将scRNA-seq从一个端点转变为一个时间和空间分析方法，使我们获得了对不稳定物质连续观测的能力，Live-seq不仅可以解决广泛的生物学问题，而且它提出了一个新的观测方法思路，也许能用在其他变化很快的生物标志物检测上。 |
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