开发｜原位杂交探针类型和探针设计

原则上，存在三种不同的原位杂交探针类型。它们是：

1)    基因座特异性探针，针对感兴趣的特定基因或基因结构。这些靶标通常与肿瘤学的诊断有关，这种探针类型包括枚举探针和易位探针。

2)    另一种探针类型是全染色体涂抹探针，用于在多色荧光原位杂交（FISH）或光谱核型中可视化大型结构性染色体畸变。使用全染色体绘画探针的技术是由细胞学中使用的传统核型技术发展而来。

3)    最后一种原位杂交探针是重复序列探针，用于重复区域或结构的可视化，如端粒、中心粒、RNA物种或病毒DNA。

针对rRNA的重复序列探针可能具有物种特异性，用于通过原位杂交鉴定微生物。

在福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE）组织上进行原位杂交以进行基因座特异性测定时，探针通常由小的双链DNA分子组成，其大小范围明确，低于500bp。荧光标签或aptens通过缺口翻译、PCR或类似技术从修饰过的脱氧核苷酸（如dCTP-荧光素、dUTP-Cy3）加入探针。双链探针与基因组中的靶标区域相同，通过变性和杂交过程，标记的探针与靶标DNA中的互补序列退火。

荧光或明视野显微镜用于探针的可视化，取决于偏好、标签类型和方法设计。荧光探针可以在FISH中直接观察，也可以转换为发色信号，然后用明视野显微镜观察。原则上，所有探针标签类型，如荧光素、Cy3、DNP、地高辛和生物素，都可以通过额外的步骤实现明视野显微镜的可视化，使用抗合剂酶联抗体或链霉菌素来引导色原在标签部位的沉积。

探针和测定设计的一个重要方面是探针是否持有非特异性或重复性序列，这些序列将存在于靶标区域之外。当存在重复序列时，通常需要阻断这些序列以抑制背景并保持测试的特异性。探针设计和商业探针生产的最新发展使得探针不含重复序列。

图1 | 荧光原位杂交信号模式的简化图。枚举探针用于量化扩增或缺失的情况。基因重排探针，如融合探针，有助于识别特定的基因融合，而断裂探针表明特定基因的断裂事件。扁平的黄色方块代表绿色和红色的部分重叠信号。

最著名的例子是HER2计数探针，用于测定乳腺癌和胃癌组织中17号染色体上HER2扩增子的拷贝数，具有很大的临床影响。联合使用HER2计数探针和具有不同标签的参考探针可在同一测试中进行，以确定染色体拷贝数的变化，并给出HER2扩增子与17号染色体中心区（CEN-17）的比率。

图2 | 根据HER2 IQFISH pharmDx产品（Agilent Technologies），HER2和CEN-17染色的乳腺癌标本的荧光显微镜图像。HER2扩增子产生来自Texas Red标记的HER2探针的红色信号，而CEN-17区域可以观察到来自异硫氰酸荧光素标记的CEN-17探针的绿色信号。图片代表HER2非扩增乳腺癌标本（左图）和HER2扩增乳腺癌标本（右图）。

图2显示了用Dako品牌的HER2 IQFISH pharmDx产品（安捷伦科技）染色的乳腺癌标本的荧光显微镜图像的真实例子。这些图像表示乳腺癌组织在荧光显微镜的双滤光片中的视图，其中红色和绿色同时被观察到。使用该产品，肿瘤细胞有微弱的红色核背景染色，在HER2非扩增组织（左图）和HER2扩增组织（右图）中均可观察到明亮的红色（HER2）和绿色（CEN-17）的特异性信号。

指示染色体拷贝数的参考探针通常测定相关染色体的中心区域，但也可能被设计为测定非中心区域。原则上，所有驱动致癌基因或肿瘤抑制基因都是原位杂交的候选基因，因为它们可能作为生物标志物具有预测和预后的作用。

ALK探针是一种易位探针，用于确定在预定的断点是否发生了DNA断裂。如前所述，该探针说明了2号染色体内的重排情况。这种类型的探针被称为断裂探针或分裂探针。易位测定的原理要求两个或多个探针一起使用（见图1）。

在断裂设计中，两个具有不同标签的探针位于一个已知的DNA断裂点的两侧。在没有DNA断裂的情况下，这些探针将呆在一起，因此它们的标签将在很近的地方被观察到。如果发生了涉及靶标区域之间的断点的易位，探针就会相互分离，这在显微镜下可以观察到间隔的信号。在被调查的肿瘤组织中发生易位事件的频率可以通过计算几个肿瘤核的事件来量化。

由断裂探针检测到的DNA断裂事件可以起到预测作用，如NSCLC中的ALK断裂探针。由于设计的原因，这种类型的探针不能识别重新排列的基因组区域。相反，双融合探针可以识别合并的特定基因组区域（见图1）。双融合探针用不同的颜色标记已知合并的独立基因组区域。在没有被测定的重排的情况下，信号是分开的。如果双融合探针所覆盖的特定重排已经发生，则单色信号消失，观察到合并的信号。

直到最近，现有的探针生成技术需要使用基因组DNA文库，在大肠杆菌或酵母中繁殖一个或多个覆盖人类靶标区域的精选克隆。在用作原位杂交探针之前，要对载体（如宇宙体、细菌人工染色体、P1衍生的人工染色体或酵母人工染色体）携带的人类DNA进行纯化、标记和片段化。尽管使用克隆和标记的人类DNA给测试设计带来了挑战，但这种技术仍被用于HER2列举和ALK重排探针的伴随诊断探针产品。

由于人类DNA同时拥有特异性和重复性的DNA元素，探针的重复性部分可能会因产生背景而影响特异性。重复性元素产生的背景可以通过使用未标记的重复性人类DNA或直接添加到探针中的PNA[17]进行阻断，或在探针生产过程中采用减法，在组织上使用前从克隆的人类DNA中去除重复性元素。最近，一种新的杂交缓冲液成分提出了另一种解决方案，其中甲酰胺被毒性较低的碳酸乙烯酯所取代。

这使得杂交时间非常短，只有1-2小时，而使用甲酰胺基杂交缓冲液时，杂交时间要过夜。随着这种新的缓冲液配方的引入和所需的非常短的杂交时间，来自重复探针元素的非特异性背景水平被降低到不再需要阻断的程度。2012年，Matthiesen和Hansen从理论上很好地解释了为什么杂交速度会影响原位杂交的背景水平。

最近在DNA寡核苷酸印刷方面的其他进展为原位杂交探针的设计提供了新的可能性。长度大于150bp的探针的寡核苷酸库可以在体外合成，经酶切扩增和标记，然后作为原位杂交探针使用。

这种寡核苷酸库的设计包括一个基因组数据库选择过程，以确保选择和合成只具有特定靶标的探针，从而避免非特异性探针序列产生的背景。探针的设计完全独立于现有的人类克隆库，而且可以对设计进行微调，以使相关的基因组畸变具有突出的特异性。利用这项技术，很容易设计出能识别非常小的靶标的探针，或者设计出两个相对的探针实体之间的间隙被精确定义的断裂探针。以前，这种设计高度依赖于现有的人类DNA克隆或费力的克隆工作。