1、直接包被抗原 当把含抗原的样品直接包被在板上时，显然不需要捕获抗体。不同浓度的样品应在包被缓冲液中制备，并将相同体积的样品直接加入到平板上。研究方案的其余部分应按照使用检测抗体和酶结合物加底物的方法进行。 2、使用酶标记的二阶抗体 当使用非生物素化的检测抗体和酶标二阶抗体时，与使用生物素化的检测抗体和链霉亲和素-HRP相比，酶的扩增会略少。因此，可能需要使用比通常用于链霉亲和素-酶结合物的二阶抗体-酶的浓度稍高。 3、使用碱性磷酸酶系统 如果要用碱性磷酸酶代替HRP来做酶结合物，必须使用AP特异性底物。在ELISA应用中最常见的碱性磷酸酶底物是p-硝基苯基磷酸酯（PNPP）。PNPP的检测极限约为每孔10纳克，而酶结合物的工作浓度范围通常为100-200 ng/mL。 4、使用荧光 使用荧光，不需要酶结合物或底物。通常情况下，荧光直接连接到二阶抗体上，或者在某些情况下连接到检测抗体或阿维丁上。标记的抗体或蛋白质的工作浓度通常为2-4 μg/mL。 信号的测量是通过配备有测量荧光的板判读仪，或使用荧光仪来进行的。 5、使用化学荧光 与荧光不同，化学荧光检测系统需要使用HRP，如主研究方案中所述。通常情况下，HRP酶结合物的最终浓度应在25-50 ng/mL的范围内。 化学荧光是用带有适当过滤器的荧光仪测量的。 6、使用化学发光 化学发光通常被认为是ELISA应用中最灵敏的检测技术，可以检测亚皮克级的抗原。出于这个原因，建议使用低量的酶结合物进行化学发光检测。 通常情况下，酶结合物的工作浓度可以在10 ~ 100 ng/mL之间变化，取决于底物的灵敏性和检测中的其他参数。 详细建议请查看底物说明。 7、ELISA竞争法 在ELISA竞争法中，检测是基于标准/样品中的抗原和同一抗原的酶结合版本之间对结合在预涂板上的有限数量的抗体的竞争。两者在同一孔中混合在一起。随着样品中抗原浓度的增加，被包被抗体捕获的标记抗原的数量会减少。 因此，光密度（OD）和样品中的分析物数量之间有一个反比关系。在检测中使用的标记和非标记抗原的数量应根据经验来确定。 |
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