技术｜传染病和寄生虫病检测技术的未来趋势

目前批准的许多寄生虫病的测试被认为受到特异性或灵敏度的限制，或对辅助部件和训练有素人员的要求。

特异性的问题正通过严格的方法来解决，以合理的抗体开发来检测特异性抗原。这种具有极高亲和力的抗体的开发会影响到检测的灵敏度。

然而，对灵敏度的最大贡献可能来自于检测平台和组件的改进，这也会影响到对集中式实验室检测的要求，因为在低资源环境下，没有受过训练的人员。

有几个因素会影响任何分析测试的质量。无论何种形式，测试的特异性是最重要的，在免疫测定领域，特异性取决于抗体和目标抗原之间的相互作用。图1中概述了产生特异性抗体的众多途径。

图1 | 抗体产生途径概述。从确定目标生物标志物开始，概述了为诊断性检测开发优越的生物识别元素的关键步骤。

多克隆试剂的使用因其产生的广泛特异性、对大量实验动物的要求和批次间的差异而受到影响。单克隆抗体的产生是产生特异性抗体的一种途径，与多克隆抗体的广泛覆盖面相比，它的灵敏度降低。传统上，由于亲和力上限的概念，这种试剂表现出低纳摩尔的亲和力[1]。

这些限制可以通过重组抗体技术来解决，该技术允许通过一些展示技术开发出亲和力极高的特异性试剂[2]。再加上先进的重制方法，这些重组抗体对诊断应用具有相当重要的意义。预计在不久的将来，基于重组抗体的诊断测试的发展将凸显出来。为了解决交叉反应问题，基于详细目标评估的知识驱动的方法可以最小化，或者如果需要的话最大化目标交叉反应。

使用替代宿主来产生抗体，如鸡，也可以帮助减少由于补体元素和人类抗小鼠抗体（HAMA）交联造成的假阳性[3]。因此，产生的试剂的质量将对所设计的检测方法的灵敏度和特异性产生重大影响。样品基质及其制备与应用的信号检测方法相结合，将对灵敏度产生巨大的影响，表1中概述的几种方法显示了改善传染病检测的复杂方法。

表1 | 正在研究中的用于检测传染病的检测方法

[a] ND，未确定；CV，循环伏安法；DLS，动态光散射法；EID50，50%鸡蛋感染剂量；EIS，电化学阻抗光谱法；EMPAS，电磁压电声学传感器；FO，光纤；LFIA，侧向流动免疫测定法；MAPIA，多抗原打印免疫测定法。MEMS，微机电系统；NALIFA，核酸LIFA；PEMC，压电激发的 mM级悬臂；QCM，石英晶体微天平；RIfS，反射干扰光谱；SPEC，丝网印刷碳电极；TCID50，组织培养感染剂量中值。

微流控方法是解决目前RDT局限性的有力方法。微流控系统正朝着本质上是「芯片实验室」的平台发展，对低资源环境有潜在的重大好处。这样的系统在一个复杂的通道、混合器和区域网络中整合了检测步骤，在微观尺度上，允许以最少的操作培训和投入来进行测试。

Weigl和同事[4]很好地回顾了微型或非仪器化的微流控设备领域。作者论述了此类设备在泵送、混合和阀控、待测物与基质分离、样品分离、浓缩和检测等方面的主要发展要求。自主地整合众多样品操作步骤的能力对提高RDT的可靠性有好处。每个设备的成本[5]相当重要，特别是在不发达的国家，制造技术正朝着聚合物微加工方向发展，以降低相关成本[6]。

除了这些新颖的微流控设备，多重检测的能力对于评估一种疾病的若干生物标志物或在一次检测中评估多种疾病的若干生物标志物也很有意义。

对于某些疾病，地理位置或病原体漂移可能会给这些设备带来潜在的限制，然而，检查多种病原体的能力、降低成本以及纳入控制、分型和耐药性测试将对低资源环境下的传染病诊断大有好处。

使用纳米结构，如金纳米粒子、超磁纳米粒子和量子点（QDots）作为新的检测方法是有意义的。例如，量子点是很方便的，因为它们只需要一个激发光，并且适合于条形码式的多重检测。

Tang和他的同事展示了一种类似于ELISA的方法，利用纳米粒子灵敏地检测受感染小鼠血清中的炭疽毒素。这种基于Europium纳米颗粒板的免疫测定（ENIA）在单克隆和多克隆抗体的夹心试验中检测出了炭疽PA，其灵敏度比ELISA格式的相同试验高出100倍[7]。

作者展示了纳米技术辅助的炭疽感染快速检测，尽管不是在微流控平台上。Sia和同事展示了纳米技术和微流控技术的融合，他们通过采用非常适合低资源环境的便携式低成本方法，开发了一种新的艾滋病毒诊断方法。该装置使用基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的软光刻技术来生成微流控表面，并将金胶体和银膜的不透明性与简单的半导体激光二极管相结合，用于HIV（gp41）血清诊断[8]。

Klostrancec和他的同事开发了一种条形码类型的方法，用于同时检测乙肝和丙肝以及HIV，该方法在微流控平台上整合了一种多重检测方法[9]。在这种检测中，特定的抗原被涂在QDot上（HBsAg、HCV NSP4和HIV-gp41），并与添加了同源抗体的人血清一起孵化，由抗物种AlexaFluor-488标记的抗体检测。当引入微流体结构时，电动力将QDot夹层输送到激光器，在那里检测荧光信号。所展示的微流控技术和纳米技术的融合实现了大约1小时的测定时间和远高于美国食品和药物管理局批准的同类产品的灵敏度。

Kim和他的同事开发了一种生物条码扩增方法，用于诊断病人血清样本中的HIV-1，使用基于纳米粒子的夹心法，然后是RT-PCR或基于芯片的扫描检测方法[10]。

后一种方法不需要酶促扩增循环步骤，可以在POC中得到潜在的应用，所设计的系统在灵敏度方面优于ELISA，其检测范围为0.1 pg/mL至10ng/mL的p24 Gag。针对帽状体p24抗原，Tang和他的同事开发了一种类似的生物条码检测和ENIA，用于HIV-1诊断，LODs分别为0.1 pg/mL和0.5 pg/mL[11]。

ENIA简化了检测方法，减少了检测时间，但仍优于ELISA的LOD（10-15 pg/mL），并被建议作为低资源环境下更可行的替代方案。Myyryl ¨ainen和同事展示了一种使用镧系示踪剂对人体样本进行时间分辨荧光（TRF）测量的HIV-1和HBV的双重时间分辨免疫荧光检测[12]。

该检测方法利用了镧系示踪剂的固有荧光，其寿命比QD长；然而，示踪剂之间的交叉干扰是一个问题，可以通过空间分辨率的多重检测来解决。

Stephens和他的同事展示了一个使用疟疾抗原Pf HRP2和金胶体结合抗体的仪器化微流控免疫测定概念。所开发的检测方法利用了无水储存的优势来稳定试剂，并证明在高温储存后仍有反应性[13]。

该测定对亚纳摩尔浓度的抗原灵敏，测定时间为9分钟。作者强调需要平衡减少的检测时间和流速以确保灵敏度。该出版物试图解决围绕试剂储存和稳定性的问题，特别强调缺乏「冷链」能力。Lee和他的同事将一些微型混合器和微型泵整合到一个微流控盒中，开发了一种灵敏的检测登革热病毒的方法，通过使用磁性颗粒和登革热病毒抗原对人类IgG和IgM进行定量，在30分钟内达到21 pg的LOD[14]。

虽然纳米技术是诊断学的强大途径，但其生物相容性和毒性是相当令人担忧的，此外，在生物相关的缓冲区中不溶解。QDots的保质期很重要，因为光漂白和氧化会导至不稳定，而金纳米粒子需要良好的表征方法来控制形状、大小和防止聚集[15]。

特别是考虑到在低资源环境下迫切需要改进灵敏的诊断方法，这种系统对最小和非仪器设备的适用性也是值得关注的。鉴于世界上68亿人中有51亿人拥有这种设备，将这种设备与移动电话技术整合是相当有意义的，这将允许对传染病的进展和传播进行全球监测。

在过去的20年里，免疫测定一直是ELISA的典范，大量的出版物展示了在各种平台、传感器表面和设备上的免疫测定。在PubMed（www.pubmed.com）中搜索「免疫测定和诊断」，可以得到超过8000条参考文献，这些文献可以追溯到1963年。免疫测定在全球健康诊断中的应用，特别是在资源缺乏地区的应用，已经在实验室中发现了许多技术和方法。

然而，许多这些方法在实验室的控制条件之外的应用将使它们对资源缺乏地区的影响变得不切实际。免疫测定在未来的快速诊断测试中可以发挥巨大的作用，无论是独立的还是集成的多重设备。目前的研究希望支持这些目标，最终，其中一些适合基于POC的诊断的新兴技术将对全球健康产生影响，并有助于诊断、管理和潜在的消除传染病。

为了实现这一目标，必须实现技术的复杂性、灵敏度、特异性、成本、可靠性和用户友好性的平衡。微流控技术、纳米技术和生物标志物发现领域令人振奋的进展，加上与通信技术的整合，有可能为控制传染病作出重大贡献。同时，为了开发拯救生命的设备，绝对需要提供大量的财政支持和跨国公司的参与。