技术｜‘荧光PCR’的荧光是什么？它有什么用？又是如何合成的？

荧光探针在分子生物学的研究和发展中已经变得越来越成熟了。许多科学家在医学、制药和绿色生物技术等领域使用这些自然界的闪亮奇迹。现在，让我们补充一下对荧光标记探针的知识，当我们的知识越丰富时，我们就越能在研究中使用荧光探针。

术语‘探针’通常用于描述荧光寡核苷酸。最常用的DNA探针是双标记的，因此由三个不同部分组成：

➤   5到35bp之间的单链DNA，负责特定的DNA识别；

➤   报告基团，在某一波长下发出荧光；

➤   猝灭基团，吸收报告基团在某一状态下发出的光。

DNA探针用适当的报告基团和猝灭基团配对标记，以利用Förster共振能量转移（简称FRET）。

FRET是一个以Theodor Förster命名的能量转移的物理过程。在这个过程中，受刺激的染料（也称为供体）的能量被转移到第二个染料（也称为受体）。然而，能量转移只有在受体和供体彼此接近时才能发生。能量的交换是无辐射的，因此不是通过光粒子（光子）的发射。

换句话说，FRET是一种众所周知的猝灭机制，取决于发射染料和吸收猝灭基团的距离。

当我们谈论DNA探针时，供体被称为报告基团，接受者被称为猝灭基团。

让我们仔细看一下发荧光是如何发出的。

荧光被定义为‘在光的照射下自发发光’。换句话说，在电子被光激发后，它进入了一个更高的能量状态。然而，这种状态是非常不稳定的。

一旦通电的电子返回到低能量状态，多余的能量就会以光子的形式发射出来。荧光有彩虹的各种颜色，这取决于它们所发射的能量。

图1 | TaqMan探针的原理。

如果是短的双标记寡头（左），报告基团（绿色）和猝灭基团（蓝色）的距离小到足以抑制荧光发射，即使是在与扩增的目标DNA结合之后。在PCR的延伸阶段，具有外切酶活性的Taq DNA聚合酶将报告基团从寡聚物上切割下来，允许荧光发射检测到目标DNA。

较长的DNA探针形成发夹、环形或线圈结构。在这种结构下，猝灭基团保持在足够接近报告基团的位置并猝灭（吸收）任何发射。

然而，一旦探针在其目标DNA上结合，报告基团和猝灭剂就会分离。

对于这些DNA探针来说，与目标DNA结合的分离已经足以中和猝灭效应。现在，发射的信号可以被检测到。

结合后发出的探针被称为杂交探针。最著名的杂交探针是Molecular Beacon、Scorpion、Amplifluor®和LUXTM（见图1）。

图2 | 分子信标探针的原理

在发夹形成过程中（左），猝灭基团（蓝色）与报告基团（绿色）保持非常接近，因此荧光发射受到抑制。与扩增的目标DNA结合（右），改变探针的构象，将报告基团和猝灭基团分开，使荧光发射能够检测到目标DNA。

探针的主要用途之一是使定量实时PCR（qPCR）的目标DNA序列可视化，由于有了荧光探针，定量实时PCR成为一种极其通用的工具。

定量PCR也可以用与dsDNA结合的荧光染料进行，其数量在PCR过程中会增加。然而，这些染料与任何dsDNA结合而不区分目标DNA和其他DNA链。相反，探针显示出更高的特异性，因为特定的寡聚物部分只与目标序列退火。

杂交探针允许进一步的应用，除了病原体的定量，还有突变检测、熔点分析和原位杂交。

此外，探针可以用不同的报告基团进行标记，从而允许多重PCR，在一个反应中检测多个目标。

第一批可用于PCR的双标记探针是分两步合成的。首先，用普通的固相合成法与磷酰胺合成一个目标特定的寡聚物。因此，最后一个核苷酸在其5'端被进一步用报告基团修饰。

在将DNA寡核苷酸从固相中释放出来后，通过将活性酯与3′端氨基耦合来添加猝灭剂。由于猝灭剂的合成后偶联并不完全有效，因此需要对所获得的探针进行纯化。不仅要从不完整的寡聚物中提纯，还要从未被猝灭的探针中提纯。最初，合成后的修饰和纯化都限制了用于PCR的探针的发展。

在90年代中期，可控孔玻璃（CPG）开始作为合成支持柱使用。CPG柱允许固态合成直接从核苷酸3′端开始修饰的寡头。对于荧光标记的探针，该柱子用3′端猝灭基团进行修饰。

截至目前，普通固相合成的结果是双标记的寡聚物。据此，我们可以说带有3′端猝灭基团的CPG柱的引入大大简化了探针的合成。

荧光探针的进一步改进是在2000年，Biosearch Technologies公司推出了第一个非荧光猝灭剂，Black Hole猝灭剂1（BHQ-1）。

到那时为止，第二种荧光染料被用作猝灭基团。TAMRA经常被用于此目的。TAMRA的问题是，吸收（557 nm）和发射（583 nm）的波长非常相似。这导至报告基团发出的信号使猝灭剂产生能量，然后发出干扰的背景信号，导至报告基团信号的检测率很低。

如果需要一种本身不发出荧光信号的猝灭基团染料，BHQ给出了一个解决方案，它的多芳基-偶氮骨架提供了这个解决方案。通过这一发现，各种具有广泛吸收范围的猝灭基团变得可用。与FRET相结合，许多报告基团的背景信号被保持在最低限度。

BHQ-1在480-580 nm范围内进行猝灭，可与常用的荧光团，如FAM、TET、JOE和HEX一起使用。

除了缺乏内在的背景荧光外，BHQ-1猝灭基团不需要改变标准的寡核苷酸合成程序。因此，可以在标准的自动DNA合成仪上完成双标记FRET探针的合成和脱保护。