1、信噪比低 1.1、低信号或无信号 信号弱表明ELISA系统需要优化。可能有很多原因，简要总结如下： 1) 检测中的一种成分可能没有被正确优化，可能存在于限制性浓度，导至整体信号低； 2) 其中一种试剂可能已经降解或被污染，在这种情况下，应该更换； 3) 使用的抗体可能不能有效地与抗原结合，或者不是有效的配对（抗体可能不能相互结合）。在这种情况下，必须测试替代抗体； 4) 检测系统（底物）可能不够灵敏，不能给出所需的信号，或者标准曲线可能不在适合样品的动态范围内。可能需要浓缩样品，或改用更灵敏的底物。 1.2、背景水平高 高背景信号最常见的原因是洗涤或封闭不足，样品成分或抗体与封闭缓冲液发生交叉反应，或使用过多的酶结合物。一个常见的误解是某一特定的底物会导至或增加背景。 然而，如果没有相关酶的活性，底物本身不能产生信号。 出于这个原因，平衡提供特定信号的酶和提供背景信号的酶是很重要的，这最好通过优化酶结合物、抗体和封闭液来控制。同样重要的是要注意，对一种抗原的最佳条件可能不是对另一种抗原的最佳条件。 如果检测系统的一个组成部分被改变（例如不同的抗体或底物），那么其他的一些组成部分可能也需要重新优化。 2、信号迅速消失（一般只见于化学发光） 当一个特定的ELISA系统产生的化学发光信号迅速消失时，该系统需要如上段所述的优化。这是因为最可能导至信号消退的原因与高背景的原因相似，即HRP过量。过量的HRP会耗尽底物，这就妨碍了光的发射。 建议检查酶结合物的浓度，确保它适合于检测中使用的特定化学发光底物。在某些情况下，可能还需要优化抗体的浓度、封闭液和洗涤步骤。 3、底物形成沉淀或平板在黑暗中明显发亮 如果比色底物在平板的孔中形成沉淀，或者如果化学发光底物在加入平板时明显发光，则说明有太多的酶存在。很可能需要进一步稀释酶结合物，尽管也可能需要优化抗体浓度，更好的封闭和额外的洗涤。 4、荧光信号很低 荧光试剂过度暴露在强光下会导至光漂白，这是由荧光基团的分解引起的。保护荧光基团不受强光照射是在检测结束时有效产生信号的关键。导至低信号的另一个原因是光淬灭，其特点是存在于彼此接近的荧光基团通过能量的分散淬灭了邻近分子的信号。 在这种情况下，可能需要重新标记以降低标记程度，或者在某些情况下，使用可溶性化学荧光底物可能更合适。 5、标准曲线线性和动态范围差 酶联免疫吸附测定的动态范围是指在一个特定的测定中可以准确测量的抗原浓度范围。它是标准曲线质量的反映，标准曲线应在重复之间有较低的变化，并有明确的线性部分。 如果标准曲线的动态范围很低，那么样品必须落在一个严格的浓度范围内，才能被视为准确。导至低动态范围的因素在「信噪比低」部分讨论。 如果曲线具有良好的线性，但重复间的变化较差（即标准误差），可能存在技术问题，如样品间或个别用户的移液不一致。为了突出移液器的错误并创造更多的可重复的结果，所有的样品和标准品都应该至少在一式两份或三份中进行测量。 此外，应校准移液器，使其在不同的检测中始终提供相同的体积。 |
/3 
浙公网安备33010802005999号 
