技术｜引物的不同类型

主要而言，引物的大小约为20个核苷酸，与靶点完全互补，经常用于PCR。然而，确实存在很多为特殊应用设计的引物变异。例如，这些引物变异可以更长，可以拥有特殊的功能、错配、标签或碱基替代物（图1）。它们可以为识别特殊的突变（如易位）而设计，也可以满足特殊的标准（如在多重配置中没有交叉杂交）。

图1 | 不同类型的引物

a 最小引物：引物，与靶点不完全匹配（也叫变性引物）。错配并不总是像预期的那样影响杂交体的稳定性。在某些错配中存在对稳定性的一些贡献。

b 外加引物：一个带有5′外挂的引物，以便将额外的序列附加到扩增物上。该序列不与本地靶点退火。这个延伸序列通常用一个间隔物与5′末端的序列相连。这个延伸序列也将在随后的循环中被扩增（见图2）。一个额外的功能被添加到扩增物中，如用于克隆的限制性位点或用于蛋白质合成的ATG起始密码子，扩增物作为一个基质发挥作用。

扩展引物在5'端含有额外的核苷酸，不与靶点杂交，在第一个PCR循环中不被复制。这些引物在第二个PCR循环后成为扩增物的一个组成部分。通过这种方式，可以添加额外的序列，如限制性位点、翻译起始序列或启动子序列，最多为50个碱基。

一种特殊的扩展引物类型配备了一个编码标签，其序列与问题相适应。这个标签可以作为标签互补引物或探针的杂交靶点（图2）。

图2 | 带有5′-外挂的标签杂交原理

在基因座特异性引物对上添加一个5′标签。该标签由基因组上不存在的序列组成。当标签成为扩增物的一部分时，就形成了一个新的靶点序列。一个带标签的特异性引物将接管扩增反应。标签有助于在与正向引物耦合的荧光色素的基础上进行识别。MLPA（见图4）使用标签扩增的原理。

标签也可以被设计成显示出独特的能力，例如形成发夹环。发夹引物利用这种构造来猝灭非退火引物的信号。扩增后，标签将最终成为扩增物中的一个线性序列。这样一来，猝灭剂和荧光剂就会分离，从而导至荧光的产生（图3a）。同样的原理适用于猝灭的探针（图3b）。有些标签有独特的序列，在自然界中不存在。通过使用多个标签，可以同时捕获多个扩增物。

图3 | 实时PCR中引物和探针的猝灭

引物（a）和探针，即分子信标（b）在溶液中不发亮，这是猝灭的结果。报告基团和猝灭者在彼此附近，从而交换激发电子（猝灭）。一旦发夹引物在PCR过程中被拉长（a）或探针与扩增物退火（b），荧光剂和报告基团将被物理分离并发生荧光。

多重连接依赖性探针扩增（MLPA）可使用另一种类型的扩展引物（图4）。

图4 | 多重连接依赖性探针扩增（MLPA）

该技术中使用了标签（见图2）。反应从双重杂交开始（探针的蓝色部分）。两个探针以头对尾的构象同时与靶点杂交。连接酶连接两个探针的 3'-5'-末端。标签序列 X 和 Y 以及填充序列（S）不杂交。每个探针组具有不同的唯一填充序列长度（S1、S2、S3 等）。这种独特的长度便于识别每个放大器。所有连接的探针都用靶向序列 X 和 Y 的相同引物对进行扩增。通过毛细管电泳区分扩增子的填充长度。

MLPA是一种PCR技术，两个探针在靶点上头尾相接地杂交。独特的标签位于两个探针的3ʹ（右）或5ʹ（左）侧。两个标签都包含一个通用引物序列（X和Y）。此外，在5'侧有一个特殊的标签，即所谓的填充序列。

这个缓冲序列的长度是可变的。引物和填充物的序列没有相互作用，如果需要，可以使用几十个不同长度的序列。在靶点杂交后，相邻的探针被连接起来。现在，可以使用与X和Y互补的引物与悬吊的标签退火，进行PCR。合成的扩增物（对10-30个不同靶点的特异性）可以通过（毛细管）电泳和/或浓缩来分离（见图5和图6c）。

图5 | 多重连接依赖探针扩增法（MLPA）

a 用于检测靶点序列A和B的MLPA法原理。两个完全匹配的（半）探针与靶点A或靶点B杂交，每个探针都有一个带有3′引物退火位点的标签（上游）。下游不仅有一个引物退火位点，而且还有一个所谓的填充序列，其长度可以变化。杂交后，探针通过一个5′-3′连接酶的磷酸糖桥进行共价连接。这样就产生了一个新的靶点序列，由引物退火位点、独特序列和填充序列组成。在所有连接的探针变性后，开始进行PCR。由于两个半探针的连接只发生在3′-5′的完美匹配处，PCR产物也只有在这时产生，这决定了这种方法的高选择性。不同填料的长度差异使得产品可以按大小进行分离。

b 毛细管电泳对PCR产物的分辨率足以检测同源性或杂合性，或者可以检测到完全缺失。第二行是BRCA1基因外显子13缺失的患者与正常质控组的对比。

图6 | 甲基化特异性PCR：原理和三种不同的检测方法

三种方法中的每一种都需要对胞嘧啶进行亚硫酸氢盐处理并将C转化为U。这样可以区分甲基化的CpG位点（保留C）和非甲基化的胞嘧啶（变为U）。

b MS-MLPA（甲基化特异性MLPA），可以检查40个位置的甲基化状态。在亚硫酸氢盐处理后的两个反应中使用两个探针。左边是一个带G的半探针的例子，可以检测到C没有变化的甲基化靶点，右边是一个带A的半探针的例子，可以识别非甲基化的位置。就像图5中一样，填料序列的长度不同。在毛细管电泳后，可以确定（副产品的长度）是否涉及同型、异型或野生型样品。

c 传统的PCR，有两种不同的测定。在「C」在亚硫酸氢盐处理后未被甲基化的位置，「C」在亚硫酸氢盐处理后未被甲基化。

在亚硫酸氢盐处理后「C」未被甲基化的位置，「C」已被转化为「U」。引物，一种是带有G/A取代的碱基的测定，另一种是带有原始「G」的引物，将选择性地结合。如果有甲基化的部分，用含有G的引物进行PCR。当C被转化为U时，用另一个引物（用A代替G）进行PCR。PCR本身是用普通的dNTPs完成的。

也可以应用一个能与新引物杂交的序列；如扩增片段长度多态性（AFLP）技术（见图7）。

图7 | 扩增片段长度多态性（AFLP）

AFLP是通过扩增不同的限制性片段来获得全基因组的图像，随后通过毛细管电泳进行分析。片段的模式可以是物种、类型或亚类型特定的

首先，用限制性酶处理基因组，造成两边都有粘性末端的双链片段。使用常用切割器（作用于相对常见的序列，如EcoRI）和罕见切割器（相对罕见的序列，如MseI，TaqI）的组合。这两种酶之间的比例决定了产生的片段数量 （a） 互补适应体与「粘性末端」杂交。使用连接酶（b）将适配体和限制性位点连接到基因组DNA上。通过这种方式，DNA被扩展成可以结合互补引物的通用序列（c）。此外，引物可以用1-3个额外的碱基进行扩展，限制了PCR产物的数量。在c中，引物被提供了三个额外的碱基（在此图中「GTA」代表MseI-引物，「AGC」代表EcoRI-引物）。完全（100%）的互补性将只出现在3′侧有限的地方；只有这样，引物才会被扩展为扩增物。

图8 | 37种HPV类型和3种质控的简化核苷酸序列比对 从病毒性HPV基因组的6582至6646位进行HPV类型的核苷酸序列比对

正向（SPF1）和反向（SPF2）用绿色矩形表示。37种HPV类型之间发现不同碱基的位置用「N」表示，排列中的同源性用「-」表示。大多数序列有3-5个不明确的地方。正向和反向序列位置的3′侧具有大多数同源性。针对HPV16的引物SPF1/2将导至完全匹配。引物中6592和6595位置的肌苷的吸收避免了与其他类型的不匹配。引物浓度和PCR条件的选择是为了使引物能与其他类型的HPV进行交叉杂交。

位置6601和6624之间的区域（黄色矩形）是高度可变的。它包含类型特异性探针的热点，可以区分使用SPF1/2引物对合成的所有37种HPV类型的扩增子。（关于碱基组成，见图2）

由于3'端的核苷酸差异阻碍了PCR的进行，引物的设计需要将5'端的非互补段与3'端的完全匹配放在一起。也可以设计一个引物，在有碱基差异的位置上有一个随机碱基或SNP的特殊组合特征。例如，「R」（A或G），「B」（C或G或T）或「N」（任何碱基）；正确的字母可在IUPAC/FASTA代码中找到。

退化的引物通常较长，以补偿杂交能力的损失。显然，错配不是绝对的；G-G、T-T、A-A和C-C之间的任何H键都有可能。然而，这将导至螺旋结构的变形和不太稳定的杂交体（图9）。

特别是在微生物研究中，以及在淋巴瘤/白血病的诊断中，可能需要用一对引物检测多个靶点（例如，使用16S rRNA基因上的类似序列的若干变异基因型的病毒或多个细菌物种）。这种引物被称为共识引物；但实际上，这些引物也被称为退化引物。

可以用肌苷替换引物中某些关键位置上的错配核苷酸。这个碱基自然存在于tRNA中，并与A、U和C化学上「匹配」。因此，肌苷可以与某些错配杂交，但对特异性没有任何贡献。

转位引物的设计是为了在转位部位的上下游进行杂交。最为人所知的是恶性肿瘤的易位，其中有些肿瘤具有特定的亚型，适合于分子诊断。

在易位时，不同的染色体重新组合成一个完整的新序列。易位引物会在断裂点的两边进行杂交，从而确保只发生与易位有关的扩增。它们不会扩增没有易位的野生型序列。

图10 | 优化多重设计的阶段和可能性。传统的PCR需要PCR后的步骤，如电泳和杂交。实时PCR方案的开发始于使用插层染料，如SYBR® Green，并结合熔解曲线分析。反应效率将使用参考曲线确定。下一阶段是对探针的优化。

多重方法在微生物学中经常被用来从活检、拭子、尿液、粪便或其他样品中的许多可能的病原体中挑选出一个。另一个应用是血液学恶性肿瘤的基因定量。

对于所有的多重PCR方案，强烈建议首先在干试验中测试所有的引物，以估计引物在单倍体PCR反应中的表现以及随后在多重PCR格式中的表现。此外，还必须在实践中使用适当的质控样品测试所有引物在多重PCR方案中的正确活性。

在大多数诊断PCR反应中，一个引物对用于扩增一个独特的靶点序列。少数诊断引物被设计成在基因组上的多个位置与相同的靶点杂交，并在同一试管中为一些不同的PCR反应提供引物。穿插重复序列，如广泛存在的简单序列重复（SSR）包含长段的简单序列。

一个著名的小型SSR的例子是（CACA）n-repeat和它的引物与重复的（GTGT）m。由于存在许多重复，引物在所有这些位点退火，初始化DNA合成将在大约40个PCR循环后产生不同大小的扩增物池（见图11）。

图11 | PCR中的引物退火点、合成方向和靶点序列

该图中描述了最重要的术语。传统PCR的靶点通常为60-400个碱基；而实时PCR的靶点为80-150个碱基。

这种「重复间」PCR中扩增物的电泳模式，即所谓的指纹，是基因组特异性的，可用于基因分型。

同样的原则也可适用于大中型重复序列（10-300 bp），如ERIC重复序列和各种BOX序列，这些序列经常用于微生物学分型。