二代测序（Next Generation Sequencing, NGS）正在改变肿瘤学的诊断前景。已有研究证明，与传统化疗相比，在特定患者群体中使用蛋白质的多重靶向治疗更安全、更有效。由于肿瘤的突变过程可能是不同的，因此，准确识别不同患者的癌症基因图谱对个性化治疗计划的制定至关重要。 PGDx Elio组织完整检测（PGDx Elio Tissue Complete）是一种新兴的肿瘤诊断技术。2020年4月，美国FDA批准了Personal Genome Diagnostics公司的 PGDx Elio Tissue Complete产品的510(K)上市申请。PGDx Elio Tissue Complete是FDA认证的一款肿瘤NGS大panel产品（507基因，全长2.23Mb，CDS区约1.33Mb），可检测癌症组织中507个癌症相关基因的SNVs，Indels，CNVs及Rearrangements，以及包括MSI和TMB在内的基因组特征生物标志物。 近日，来自约翰霍普金斯大学医学院Sidney Kimmel综合癌症中心的研究团队对新的PGDx elio组织完整检测进行了开发和分析验证，提供了一种具有高分析性能的泛实体肿瘤综合基因组图谱的方法，将其应用于全面基因组图谱分析中可以为患者提供更精确的肿瘤治疗。研究团队将结果发表在Nature Communications上，文章题为“Automated next-generation profiling of genomic alterations in human cancers”。 文章发表在Nature Communications上 研究团队对癌症基因组图谱（TCGA）项目中的WES数据进行了分析，随机选择100kb-2.5Mb的外显子来评估不同大小的靶向组对肿瘤突变负荷（TMB ）的预测能力，分析了4174例已获批准用于治疗或正在进行检查点抑制剂治疗（CPI）临床试验的癌症的非同义突变，并根据每年诊断出的晚期癌症病例的相对估计数量，重新加权肿瘤类型特异性结果计算了一般转移性癌症人群的性能。分析结果显示，与泛实体肿瘤队列中的WES相比，靶向panel的大小至少为1.0 Mb时才能准确预测TMB。基于上述结果，研究团队设计了一个靶向panel（图1），其包含505个基因的1.3Mb编码区，能够实现准确的TMB分析。此外，为评估整个基因组重复区域中的结构变异和微卫星不稳定性（MSI），研究团队纳入了额外的0.9 Mb内含子区域，最终组合的靶向panel大小为2.2 Mb。
图1. 通过PGDx elio组织完整检测测定序列和结构改变。 研究团队使用PGDx elio组织完整检测以及FDA批准的两种基于NGS的肿瘤图谱分析方法（MSK-IMPACT、FoundationOne）对112个FFPE肿瘤样本进行了分析（图2）。结果显示，PGDx elio组织完整检测的阳性百分比一致性 (PPA) 为 97.2%。在研究队列中，通过PGDx elio组织完整检测确定了两个具有临床意义的SNV。在与治疗或临床决策相关的变异以及潜在生物标志物的显著性变异中，PGDx elio组织完整检测均显示出较高的分析性能。 
图2. 由PGDx elio组织完整检测鉴定的序列变异的基因组图谱。为评估从PGDx elio组织完整检测技术中TMB评分的精度和运行可重复性，研究团队分析了6个含有细胞系混合物的样品、1个未改变的细胞系和14个FFPE癌症标本。每个样品的两个重复分别在三个独立的位点进行，每个位点有两名操作员，每名操作员在三个不同的日期和至少一个仪器上准备两个重复，每个样品总共至少33个重复，总观察计数为829（图3）。结果显示，跨重复报告结果之间存在高度一致性。所有样本中，在相同运行中的总变异系数（CV）最高为5.6%，日期之间为1.8%，位点之间为2.1%，操作员之间为1.8%。此外，跨重复实现的覆盖率具有高度可重复性，总CV范围为8.5%-16.4%，不同覆盖率为12.6%-26.3%。上述数据证实在临床实验室的正常运行条件下，PGDx elio组织完整检测具有高精度和可重复性，这是分散系统量化FFPE肿瘤标本TMB的关键要求。 图 3. PGDx elio组织完整检测中eTMB的分析精度和重现性。在结直肠癌和胃癌中，MSI是一种有效的生物标志物，但在其他癌症中MSI的发生率显著较低。为开发一种NGS方法来检测FFPE肿瘤样本中的MSI，研究团队确定了PGDx elio组织完整检测目标区域内所有单、双和三核苷酸重复序列，分析了36个微卫星不稳定性高（MSI-H）和96个微卫星稳定（MSS）的临床样本，评估了候选片段区分MSI-H和MSS状态的能力（图4）。此外，研究团队还应用之前开发的MSI寻峰分析算法，对FFPE肿瘤组织分析进一步修改，用于68个重复片段。结果显示，PGDx elio组织完整检测训练集中获得的MSI状态与基于重复片段的方法达成了100%的正负百分比一致性。 
图4. PGDx elio组织完整检测中MSI检测算法的训练和分析验证。为评估组合MSI算法的准确性，研究团队使用PGDx elio组织完整检测评估了全实体肿瘤队列中223个临床FFPE标本，总共生成了2232Gb测序数据，平均每个肿瘤获得了972倍的不同覆盖率。此外，通过多重PCR鉴定的143个MSS样品中，99.3%的样品通过组合方法被评定为MSS。上述数据表明，在PGDx elio组织完整检测中使用重复序列和突变特征的组合方法可以准确地对各种错配修复缺陷肿瘤的MSI状态进行分类。最后，为了评估MSI算法在分散的实验室环境中的可重复性和精确性，研究团队分析了6个包含细胞系混合物（3个MSI-H和3个MSS）、1个未改变的细胞系（MSS）、7个MSI-H FFPE癌症标本和7个MSS FFPE癌症标本。经计算，在不同地点、不同操作者和不同天数的所有比较中，平均阳性和平均阴性一致性分别为99.1%和99.3%，突出了PGDx elio组织完整检测技术的性能，其能够产生的精确、重复地MSI结果。 图5. PGDx elio组织完整检测中MSI检测算法的分析精度和重现性。综上所述，由于缺乏针对癌症患者的经验证、分布式的全面基因组图谱分析，精确肿瘤治疗途径的研究受到了限制。为了解决这一问题，研究团队对PGDx elio组织完整检测进行了开发和分析验证，该测试包括一个2.2 Mb的靶向基因panel，一个成套的样品制备系统，以及一个伴随的自动化生物信息学分析平台，实现了对序列和结构变异的全面基因组分析，以及对实体瘤患者的基因组特征（如TMB和MSI）分析。参考文献 Laurel A. Keefer, James R. White, Derrick E. Wood. et al.Automated next-generation profiling of genomic alterations in human cancers. Nat Commun 13,2830 (2022) . https://doi.org/10.1038/s41467-022-30380-x
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