技术｜如何为侧向层析免疫测定选择合适的膜

侧向层析免疫测定，或免疫色谱测定，是一种快速、方便的测试，使用抗体（有时是抗原）来检测特定的大分子，如抗原、药物物质或其他蛋白质。

侧向层析快速检验开发的第一步是选择‘合适的’材料，特别是硝化纤维素（NC）膜。NC是侧向层析试验的核心，目标分子在此被结合，结果在此显示。

一个成功的侧向层析免疫测定取决于一系列的反应。在选择免疫测定开发的材料时，必须同时考虑膜的特性和试剂的特性，因为它们的相互作用决定了测试开发的结果。

在选择膜时，你必须考虑各种材料和特性将如何与你的试剂和样品相互作用，以满足你的灵敏度、特异性和测试时间等测试目标。影响你的样品和膜之间的相互作用的因素包括：

➤  样品液体的粘度；

➤  测试试剂与膜表面活性剂的相容性；

➤  结合试剂的动力学特性。

毛细管流动时间是液体（通常是水）沿着平行于膜表面的规定距离（通常是4 cm）迁移所需的时间，使用规定宽度的膜条（如1 cm）。详情请见图1。时间越短，膜就越‘快’。

图1 | 膜毛细管流动时间测量的基本设置

试剂条宽度为1 cm，长度为4.5 cm，在长度4 cm处有三角形标记。液体（水）到达这些标记的时间被记录下来。水的体积是100 μL。

随着与膜底部的距离增加，迁移的液体在膜的任何一点的停留时间也会增加。捕获试剂离膜的底部越远，捕获试剂就有越多的时间来寻找和结合它的目标（图2）。试验开发者可以利用这一事实来提高试验性能。

图2 | 人血清在侧向层析膜上的毛细管流动时间（带水的毛细管流动规格：120 ~ 160 s）。使用图1中概述的方法，在离膜底部的不同距离上测定人血清的毛细管流动时间。血清的流速随着与膜条底部距离的增加而减少，所以流速作为膜规格并没有太大的价值。

将图2中的膜毛细管流动时间规格（水）与血清毛细管流动时间进行比较，可以看出样品液体的粘度如何影响测试时间。

粘度越大，毛细管流动时间就越长，从而导至测试时间延长。处理长测试时间的常规方法是选择一个毛细管流速更快的膜。这将必须与捕获试剂的动力学特性相平衡。

毛细管流动时间规格可以提供膜是‘快’还是‘慢’的指示，但是你必须用你的样品进行测试，以确定它是否可以满足你的测试要求。

毛细管流动时间规格一般是在一个范围内给出的。虽然一个膜的大多数样品会落在这个范围的中间，但有些可能会落在任何一个边缘。评估您的样品和测试试剂是否与特定的膜等级兼容是非常重要的，即使它是在规格的一个边缘制造的。可能的问题在图3中指出。

图3 | 关于侧向层析测试要求和膜毛细管流动时间的可能问题

市场上的每一个硝化纤维素膜都含有一种表面活性剂，通常是阴离子表面活性剂。表面活性剂的确切性质是每个膜制造商的专利，但表面活性剂的功能总是相同的。首先，它使膜具有亲水性。其次，也许更重要的是，它帮助蛋白质与膜结合（图4）。

图4 | 蛋白质与NC膜结合过程的示意图

好消息是，表面活性剂在缓冲液中使分配到膜上的蛋白质部分变性并帮助它们与NC纤维结合。

坏消息是，表面活性剂使蛋白质变性。这有可能完全破坏一些单克隆抗体的抗原结合位点，使这些试剂在侧向层析测试中无法使用。

根据以往的经验，大约2 ~ 3%的克隆物受到这个问题的影响，而其他克隆物则部分受到这个过程的影响。在这些情况下，评估不同的膜与不同的表面活性剂对你的特定分子和试剂的性能是有意义的。

一种特定的捕获试剂，如单克隆抗体，是否能提供侧向层析快速检测中所需要的灵敏度和特异性，不仅取决于所使用的膜，以及膜中加入的表面活性剂；还取决于捕获试剂的动力学特性。

抗体的亲和力是由其导通率决定的，即抗原结合位点抓取其目标的速度，以及其关闭率，即结合的抗原从结合位点再次释放的速度。如图5所述，对特定目标具有相同亲和力的抗体可能具有非常不同的导通率和断通率。

图5 |特定抗原具有相同亲和力的不同单克隆抗体的动力学特性

这些数据是使用表面等离子体共振和Cytiva Biacore设备获得的。开通和关闭速度慢的抗体（左）与开通和关闭速度快的抗体（右）很容易具有相同的亲和力（中间）。

抗原在侧向层析检测的检测线上的停留时间通常非常短，总是低于一分钟，有时只有几秒钟。因此，侧向层析快速检测需要有高导通率抗体。

一个测试开发者应该在测试系统本身评估所有可用的目标抗原捕获蛋白，或者更有利的是在选择抗体之前通过表面等离子体共振（SPR）进行评估。后一种方法使开发者能够排除具有明显不利的结合或释放动力学特性的克隆。

如果仅仅因为没有替代物而必须用一对特定的捕获和检测试剂来开发测试，那么灵敏度目标和测试持续时间目标之间可能会有冲突，这些目标在开发开始前就已经确定了。具有慢速导通率的捕获试剂可能导至在快速膜上的低灵敏度测试，尽管只有这种膜为开发者提供了‘正确的’测试持续时间。

如果发生这种情况，有时有助于寻找具有不同的表面活性剂和/或表面活性剂浓度的膜，但是最终的结果可能是，要么测试开发的原始目标必须调整到用这组试剂可以实现的程度，要么可能必须开发新的试剂。

用于侧向层析检测的膜有不同的毛细管流动时间和不同的表面活性剂含量。流动时间受样品液体的粘性影响。流动时间越慢，从样品液体的背景中清除膜的时间就越长，测试需要的时间就越多。

另一方面，缓慢的流动时间可以使目标物在检测线上有更长的相互作用时间，这可以提高检测的灵敏度和特异性。

膜的特性和试剂的特性并不是相互独立的：它们的相互作用将决定一个测试开发的结果。

例如，在一个特定的试验开发中使用的试剂可以在快速膜上使用低粘度的样品，或者它们可能需要使用慢速膜，即使是高粘度的样品。膜上使用的表面活性剂可能会影响你的样品的结合能力。