传染病可能由各种细菌、病毒、真菌和寄生虫引起的,找出罪魁祸首是治疗和解决问题的关键。虽然有些传染病的特征非常明显,很容易识别,但另一些的特征并不明显,比如新冠病毒,无症状患者难以被发现,待发现的时候,就已经造成了二次传染,因此难以有效防治。 本文将重点介绍传染病的诊断,包括检测病原体本身和病人的反应,以及用于实现这一目的的检测技术。 01 · 传染病诊断试剂可以检测什么? 传染病诊断试剂可以根据其待测物分为四类,这四类试剂包括: 1.1、病原体检测 检测病原体的方法包括检测完整的病原体本身、其遗传物质(DNA或RNA)或其形成的分子(蛋白质、糖类等),其中一些将具有抗原性。培养和随后的生化测试或显微镜检查可以直接识别病原体。聚合酶链式反应(PCR)技术和第二代测序(NGS)可用于检测遗传物质,而酶联免疫法(ELISA)、侧向层析法和质谱(MS)可用于检测病原体的抗原,如果是质谱,则用于检测其化学成分。 需要注意的是,当采集样本时,不是每次都能采集到病原体,这和采样位置以及采样时间有关,这一点在新冠检测过程当中非常明显,所以,我们还需要检测患者对病原体的反应,这样才能确保检测结果的完整和可靠。 1.2、检测患者对病原体的反应 早期的免疫标志物,如中性粒细胞,可以在感染部位用显微镜观察到。随后可以通过ELISA和侧向层析法来检测反应性抗体。 感染的生物标志物可能有多种形式,包括血清或尿液蛋白、代谢或遗传标志物。虽然生物标志物不一定能确定具体的病原体,而是它引起的状况,如败血症,可以帮助指导进一步的诊断和治疗。 02 · 用于诊断传染病的检测方法 有许多不同类型的检测方法,包括在实验室使用的和在医疗点使用的,都可以用于诊断传染病。有的检测病原体,有的检测患者对病原体的反应,而有的则可以适用于这两种情况。下面我们介绍一些常见的技术和它们的优缺点。 2.1、培养法 直接培养病原体(细菌、酵母和真菌通常在营养培养基中,病毒则在细胞或胚胎鸡卵中)需要在实验室条件下从样品中成功复制目标。然后可以用生化测试来鉴定病原体。这种技术在很长一段时间内被认为是诊断许多感染的金标准,现在依然如此。 2.2、显微镜镜检 显微镜镜检可以用于直观地识别病原体,通常借助于染色剂或标签,例如通过革兰氏染色来区分革兰氏阴性和阳性细菌种类。 它还可以用来寻找宿主对感染的免疫反应的证据,如中性粒细胞对感染部位的组织的浸润。 2.3、PCR/qPCR 在PCR中,病原体的遗传物质(DNA或RNA)被特异性引物从样品中扩增出来。然后通过凝胶电泳检测PCR产物(传统PCR)或通过扩增过程的荧光信号(qPCR)来确定病原体的存在或不存在。也有其他的PCR技术,如数字PCR(ddPCR),它直接输出阴性或者阳性结果。基于PCR的检测结果通过与阳性对照的比较来确认。检测对照可以是部分或全部病原体基因组的合成版本。使用微流控PCR的检测方法也在出现,PCR的整个流程被整合到一个卡盒中进行,这使得该技术非常适合于护理点或床旁检测。这种技术通常用于检测病原体。 2.4、基因测序 基因测序确定构成基因组或目标基因组区域的核酸序列。样品中的基因组被分割成片段,对这些片段进行测序,然后用重叠区域或模板作为指导进行重建。在传染病诊断中,这种技术通常用于检测病原体。基因测序也可用于病原体监测,以检测可能正在演变的基因变异。这在为治疗和疾病管理提供信息以及提醒科学家注意疫苗或其他诊断方法是否存在潜在失效或者误报的可能性。 2.5、酶联免疫法 酶联免疫法是一种免疫学检测方法,常用于测量生物样品中的抗体或抗原,依靠抗体与其目标的结合来进行检测。检测结果通过颜色变化来表示,并通过紫外线-可见光分光光度法来测量。 该技术用于检测病原体或患者对病原体的反应,这取决于采用何种检测方法。目标抗原可以结合在检测板上,以捕捉检测样品中的特异性抗体(由患者对病原体反应产生)。另外,识别特定目标抗原的抗体可以被固定在检测板上,以结合和检测样品中的特定抗原(如细菌或病毒蛋白)。 2.6、侧向层析法 侧向层析法利用了酶联免疫法所基于的相同的抗原-抗体相互作用。然而,在这种情况下,检测抗原或抗体被结合到一个膜上,样品与检测用的结合物混合后流过膜。 若对照线用于表示检测是否成功,而检测线用于表示目标抗体或抗原是否存在。与酶联免疫法一样,侧向层析法可以被用于对某一特定抗原的抗体或抗原本身的检测,这取决于其形式。与酶联免疫法不同的是,在一个测试中可以进行多重检测,同时检测多个目标。 2.7、质谱法 质谱法(MS)通过分析分子离子的质荷比(m/z)来确定组成样品的分子,并在过去十年中被证明对在快速鉴别细菌方面具有很大的价值。每个物种的特征光谱被识别出来,然后与仪器内的一个大型数据库相匹配。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)是为此目的最经常使用的质谱仪。虽然主要用于细菌鉴定,但在病毒鉴定方面的质谱应用也正在开发中。 03 · POCT检测 VS 实验室检测 3.1、选择需考虑的因素 选择使用基于实验室的检测还是护理点的检测,可能取决于许多因素,包括: Ø 出具诊断结果的时间:实验室检测通常比POCT检测慢。 Ø 对实验室能力的要求:POCT检测对实验室能力没有要求。 Ø 检测的灵敏度和特异性:从经验上看,基于实验室的检测往往可以提供更高的灵敏度和特异性,但是POCT检测的灵敏度和特异性一直在提高。 Ø 感染阶段:在感染早期无法检测到抗体,同时病原体可能无法在感染的所有阶段都检测到。 Ø 成本:实验室检测的成本往往更昂贵,但有的时候不是这样。 Ø 检测项目的全面性:并不是所有的检测项目都可以采用POCT检测的模式。 Ø 检测的目的:调查、诊断、筛查、个体诊断、大规模检测…… 3.2、举例说明 例子1 你被一种未知病原体感染了,目前正在医院里,希望从几种可能性确诊感染的原因。虽然有许多种检测可控选择,但基于实验室的检测具有更大的灵敏度和特异性。 在这种情况下,如果有检测试剂和检测设施,而且患者已经在护理环境中,那么灵敏度和特异性将是关键,使用基于实验室的检测可能是最佳选择。 例子1 你被一种未知病原体感染了,目前正在医院里,希望从几种可能性确诊感染的原因。虽然有许多种检测可控选择,但基于实验室的检测具有更大的灵敏度和特异性。 在这种情况下,如果有检测试剂和检测设施,而且患者已经在护理环境中,那么灵敏度和特异性将是关键,使用基于实验室的检测可能是最佳选择。 例子2 你在国内的偏远地区,正在利用捕捉和释放设备对一个野生动物群体进行某种特定的感染筛查。如果要使用实验室检测的话,需要将样本运送到30公里外的市区。 在这种情况下,由于交通不方便和检测结果反馈的很慢,所以最好选择POCT检测。 例子3 你想在允许入境前对入境旅客进行某种传染病的筛查。你有相应的实验室设施,实验室检测和POCT检测均可以使用,并且两者的灵敏度和特异性很接近。 在这种情况下,需要的是速度,所以最好的选择是POCT检测,因为即不需要牺牲检测能力,又获得了速度。 在上面这些例子中,该如何选择似乎是显而易见的,但在显示生活当中,往往需要进行权衡,例如,POCT检测的灵敏度低于实验室版本,但由于后勤或成本原因,还是必须采用POCT检测。 04 · 未来的诊断格局 传染病诊断在不断发展,最近在SARS-CoV-2诊断和监测方面需求的刺激下,传染病诊断正在高速发展。 基于生物传感器、快速诊断和其他医疗点解决方案的新型测试技术正在不断涌现,同时正在努力提高现有测试方法的灵敏度和特异性。随着测序和质谱等技术在可用性和单位测试成本方面继续变得更加容易被接受,它们也越来越多地在常规测试中找到自己的位置,并在诊断和检测新出现的变体方面发挥着重要作用。 |