单域抗体（纳米抗体）在实验室诊断中的应用

几十年来，抗体经历了从多克隆抗体到单克隆抗体的里程碑式发展，已被证明是发展诊断方法的核心。尽管单克隆抗体在诊断中发挥着重要作用，但是它们的生产对技术要求很高，且价格昂贵，体积较大，使得它们在重组方法中的再设计成为挑战。单域抗体，如“纳米抗体”，是一种相对较新的诊断探针，在骆驼血清的检测中偶然发现。骆驼科（骆驼、美洲驼和羊驼）的免疫系统已经进化得可以产生独特的重链抗体，这些抗体有更小的功能单元，大小约12-15 kDa，其中中包含了一个单一的单体可变抗体结构域。有趣的是，鲨鱼中也发现了同样的生物学现象。由于单域抗体分子比传统的哺乳动物抗体小，利用细菌生产系统进行的体外重组工程和蛋白表达就要简单得多，编码这种抗体的整个基因都可以在体外克隆并表达。单域抗体非常稳定，并且耐热，因此不需要冷冻保存，特别是在用于诊断试剂盒时。它们简单的遗传结构允许对蛋白进行简单的改造，以引入新的抗原结合特性或连接标签。本文综述了单域抗体在实验室诊断中的应用，并讨论了这一领域的发展前景。 

【内容】

1.  一般免疫分析

配体结合分析是检验医学中测量分析物和生物标志物的基础，这种检测方法利用了被分析物或生物标志物与其特定亲和试剂间的结合反应。在免疫分析中，亲和试剂就是抗体。

免疫分析法是测定蛋白生物标志物的中流砥柱，许多蛋白质都可以在生理或病理的状态下被检测到。临床样本中，一些靶蛋白浓度很高，达10 mg/mL以上，然而也有另一些浓度很低的靶蛋白，小于1 pg/mL。一种合适的免疫分析方法的建立取决于蛋白质抗原的有效性、宿主动物体内免疫反应的发生以及后续抗体的产生。由于免疫反应固有的多样性，并且同一抗原产生的不同抗体的结构和亲和力不同，抗体如果不是来自同一株单克隆抗体，那么在不同试验或平台中的表现就会各不相同。蛋白质分析物的翻译后修饰可能是另一个影响抗体的反应性并导至不同结果的因素。

然而，免疫分析法中有许多问题。总的来说，抗体分为多克隆抗体和单克隆抗体。多克隆抗体虽然很容易产生，但本质上是多变的，不同批次的血清之间可能存在差异。多克隆抗体具有能够识别复杂抗原的多个表位的优势，但生产中的不一致性阻碍了其应用。单克隆抗体的发展是基于配体的检测方法进化历程中的一个里程碑，单克隆抗体识别单个表位，可以通过杂交瘤以纯粹均质的形式无限生产。虽然单克隆抗体在诊断中有重要作用，但它们对生产技术要求很高，价格昂贵，并且分子大小达150 kDa，这使得它们在重组方法中的再设计面临挑战。因此，实验室诊断迫切开发可靠的新抗体探针。传统的抗体或互补的核酸序列是检测各种靶分子的最常见探针形式。多年来，人们一直在尝试通过酶消化（如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶）或重组工程的方法将抗体变成片段，比如使用抗原结合片段(fragment antigen biding，Fab)、单链抗体(single chain variable fragment，ScFv)和可变区片段（fragment variable，Fv）。骆驼中的天然重链抗体（heavy chain-only antibodies，HCAbs)的发现昭示着抗体工程的新时代。

2.单域抗体：产生及特征

脊椎动物的典型抗体含有两条一样的重链与两条一样的轻链。骆驼科动物（骆驼、单峰驼、美洲驼、骆马、小羊驼和羊驼）的免疫系统进化得十分独特，可以产生约90 kDa的HCAb二聚体，不含轻链与重链第一恒定区（the first constant heavy chain domain，CH1）（图1）。哺乳动物中，仅有骆驼科成员能产生内源性功能性的只有重链的IgG。有趣的是，鲨鱼中也观察到了类似的生物学现象。软骨鱼类，包括护士鲨（铰口鲨）、斑纹须鲨（斑须鲛）、角鲨（海绿角鲨与玲珑星鲨）也特异性地产生有功能的重链免疫球蛋白（heavy-chain-only immunoglobulins，HCIgs），被称作免疫球蛋白新抗原受体（Ig new antigen receptor，IgNARs）。软骨鱼的IgNAR也是两条重链的同源二聚体，具有一个可变区和五个恒定区。在软骨鱼中，IgNARs仅占总Igs的5%左右；各种骆驼科动物表达不同比例的HCAb，从骆驼的50-75%到美洲驼的20-40%不等。

图1 典型Ig与重链抗体的结构比较。

缩写：V_HH，variable heavy chain-only antibodies重链抗体可变区；C_H，constant region of heavy chain重链恒定区；V_L，variable region of light chain轻链可变区；V_NAR，variable domain of immunoglobulin new antigen receptor免疫球蛋白新抗原受体可变区。

在比利时布鲁塞尔自由大学为研究生开设的实验室课程中，偶然发现了骆驼血清中天然存在独特的、功能性的同源二聚体HCIg。与典型的哺乳动物抗体不同，HCIg包含一个完整的抗原结合结构域，即HCIg的重链可变区（variable domain of heavy chain of HCIg，VHH）。软骨鱼中VHH的对应物是IgNAR的可变区（variable domain of IgNAR，V-NAR），该单域片段仅包含两个参与抗原结合的高变环结构，而VHH包含三个识别抗原的高变环。据推测，HCIgs中CH1的缺失是由于进化过程中“CH1铰链”内含子5'端的剪接共有信号丢失造成的，这种剪接的改变导至HCAb的CH2域独特地通过“铰链”区连接到可变区。

在骆驼科动物的重链IgG中有两种不同类型的铰链：短铰链和长铰链。VHH类似于传统的VH结构域，但与其在序列和结构上存在差异，主要体现在它的序列在与轻链可变区相互作用的区域中有一些关键的氨基酸被取代。VH中大型疏水性氨基酸与VHH中较小的亲水性氨基酸的取代，是造成VHH可溶并且在VL不存在时也具有功能的原因。

因此，这些结合抗原的可变区（VHH和V-NAR）在12-15 kDa的小单位内仍具有完全的功能。VHH大约有120个氨基酸残基，由360 bp的基因编码，该基因很容易被克隆和亚克隆。大约13 kDa的蛋白质大小完全在细菌表达的范围内，可与ScFv（25 kDa）、Fab片段（57 kDa）和完整的IgG（150 kDa）一较高下。

VHH分子构成了生产小的、重组的、自主的单域抗原结合片段的基础。 “纳米抗体”一词是位于比利时根特的Ablynx公司于2003年创造的商标，但现在它被广泛用于描述小的、重组、自主的单域抗原结合蛋白，它们体积很小，仅有13 kDa，直径2.5 nm，长度4 nm。这些纳米抗体成为一类相对较新的诊断探针，最初由布鲁塞尔自由大学提交的关于使用HCAb衍生片段的专利于2014年到期，使得人们对纳米抗体商业化的兴趣增加。

纳米抗体的生产过程始于对骆驼的免疫，随着免疫反应的发展，可从外周血或淋巴结中分离出B淋巴细胞并从中分离出mRNA。然后将mRNA逆转录产生cDNA，并使用VHH特异性引物进行PCR，扩增VHH基因区域，再将其克隆到噬菌体展示表达载体中以生成文库。因为VHH已包含HCIg的全功能抗原结合区，所以仅需要VHH而不是整个HCIg的引物。

构建初始或合成的cDNA文库能绕过动物免疫过程，因此也可以从非免疫文库中获得VHH。免疫文库具有更大的多样性，通常会产生具有更高亲和力的VHH。与靶标弱结合的反应性VHH可以通过随机或定点诱变进行修饰，从而分离出具有更高亲和力的抗原结合物。

使用固相固定的蛋白质抗原（例如固定在磁珠上），可以通过在细菌培养过程中重复筛选和扩增分离出噬菌体表达的反应性纳米抗体，然后将噬菌体插入物亚克隆到细菌或酵母表达载体中。VHH基因也可以通过随机诱变改变亲和力和特异性，这也可以通过融合到各种短肽免疫分析标签（His6、c-myc、HA、Avi、ALFA和C标签或各种酶（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或溶血素）来实现。纳米抗体构建体可以在mg-g/L范围内的微生物培养物中无限生产，这对于蛋白质生产来说十分高效。然后可以通过各种免疫分析方法测定识别靶标的纳米抗体克隆的反应性和实用性，包括夹心或竞争性ELISA、化学发光酶免疫分析法（chemiluminescent enzyme immunoassay，CLEIA）、生物发光酶免疫分析法（bioluminescent enzyme immunoassay，BLEIA）、侧向流动层析（lateral flow assay，LFA）、微流体和用于即时检测的电化学设备等。

典型的纳米抗体具有纳摩到皮摩范围的亲和力（平衡解离常数），所以它们非常适合用于配体结合测定。它们与抗原结合时亲和力与传统IgG相当，即使它们缺乏构成IgG抗原结合区的轻链。由于整个纳米抗体分子的功能部分比传统的哺乳动物抗体小，因此使用纳米抗体在体外通过细菌生产系统进行重组工程和蛋白质表达要简单得多，整个纳米抗体基因都可以在体外克隆和表达。后来在1997年发现，纳米抗体在37°C下长时间孵育（两周）后仍保留结合特性。而且，纳米抗体在更高的温度下也非常稳定，其耐热性意味着并不需要冷藏储存，尤其便于将其纳入诊断试剂盒中。纳米抗体对极端pH值的耐受性使其有可能被开发成口服药物。此外，编码纳米抗体的基因结构简单，可以对纳米体的抗原特征进行再设计，“人源化”后用于治疗。纳米抗体可用于开发实验室诊断试剂的特性如下：

①  生产成本低

②  易于编辑以满足应用要求（即提高特异性和亲和力以扩大检测可能性）

③  坚固耐用，保质期长

④  靶向隐蔽的或隐藏的抗原决定簇

⑤  免疫原性低，血液清除率快：

3.     抗原抗体复合物中纳米抗体的三维结构

纳米抗体的平均亲和力约为6 nM，这与常规抗体中单体抗原结合位点（Fab或ScFv）的亲和力相当。X射线晶体学已经揭示了许多纳米抗体的结构。VHH含有一个带9个β链的IgV折叠，在Cys23和Cys104之间有一个的保守二硫键（IMGT信息系统编号；图2），V区包含由四个保守框架区域连接的三个高变环。纳米抗体上的互补位富含与传统抗体相似的芳香残基，纳米抗体和抗原之间的相互作用由三个互补决定区（complementarity-determining region，CDR）介导，并由CDR3支配。抗原表位更加刚性，呈凹面凹面，富含芳香残基。相比之下，传统抗体通过六个CDR环与抗原结合，其中三个在重链可变区，三个在轻链可变区。对纳米抗体的结构解析有助于将其合理设计成更有效的亲和试剂。

4.     纳米抗体的应用与检测性能

关于哪些免疫测定应用最适合用纳米体替代经典抗体的问题仍然存在。纳米抗体已被广泛用于各种实验室诊断技术，主要用于传染病检测。考虑到其低生产成本和耐热性（即使在没有冷链的情况下也具有较长的保质期），纳米抗体有望成为未来LFA中首选的亲和试剂。纳米抗体可能不太适用于“孕检”之类的检测，但适用于监测生活在偏远地区的动物（农场和野生动物）的传染病，目前已有人使用纳米抗体监测锥虫和登革热。

除LFA外，还评估了纳米抗体在基于ELISA的方法中检测各种靶标的能力。 尽管生产针对半抗原的纳米抗体具有挑战性，已经有了针对多种小有机化合物的纳米抗体，这些纳米抗体与灵敏的检测技术或竞争性ELISA相结合，有望成为监测土壤或食物中污染物的宝贵工具。为此，首先必须从土壤或食物中提取污染性除草剂、杀菌剂或杀虫剂。这些污染物中的许多是疏水性的，难溶于水，而且在二甲亚砜、甲醇、丙酮和其他有机溶剂中提取时也与蛋白质探针不相容。然而，稳定的纳米抗体似乎对暴露于此类非生理溶质具有抵抗力。

LFA和标准夹心ELISA对特别难以测量的目标（即糖基化、参与可变组装或以极低浓度存在的生物标志物）的灵敏度似乎不足，在这种情况下，可能需要切换到更灵敏的检测方法，例如CLEIA或BLEIA，或者利用更复杂的新诊断仪器，如（磁）电化学传感器。纳米抗体的灵活形式和小体积的优势使其可以在磁珠或新型生物传感器的传感器层上进行高密度定向耦合和调整。例如，前列腺特异性抗原（prostate specific antigen，PSA）夹心免疫传感器的检测限为0.08 ng/mL，范围为0.1-100 ng/mL，远低于临床检测下限4 ng/mL，而PSA的表面等离子共振测定的检测限为0.3 ng/mL，可见纳米抗体与使用传统抗体的自动化平台形成鲜明对比。利用纳米抗体进行生长激素测定的方法在灵敏度方面具有类似优势，其检测范围为0.5–110 ng/mL。最近对弓形虫排泄分泌物进行的高度可重复的灵敏度与特异性检测中，更是让纳米抗体的应用达到了前所未有的高度。

【结论】

    尽管学术机构为了将纳米抗体引入标准ELISA中以监测人类健康相关的生物标志物已经做了许多努力，但要在这些应用中替代成熟的经典单克隆抗体是极其困难的（参考HCG测试示例）。然而，有一个值得注意的例外，就是体内非侵入性成像。纳米抗体的小尺寸使它们能够迅速从静脉中渗出并均匀地扩散到组织中以接近它们的靶标。同时，多余的纳米抗体可以通过肾脏迅速从血液中清除。因此，基于纳米抗体的特异性，静脉注射放射性核素标记的纳米抗体会分布在全身，而肾脏清除会去除多余的游离纳米抗体，并在体内的病变部位积聚一小部分。如果希望延长半衰期以改善成像，则可以将纳米抗体与其他蛋白质偶联。患病、感染或发炎组织的病变或斑点将装载有标记的纳米抗体，这些纳米抗体可以通过PET或单光子发射计算机断层扫描全身扫描进行监测。这种极具前景的非侵入性成像技术已被用于小鼠研究，其中纳米抗体可以针对癌症生物标志物和炎症部位，已经有了一项针对乳腺癌患者的抗HER2纳米抗体的I期研究的报道。如本综述所示，用于诊断目的的纳米抗体未来可能会在临床实验室中越来越多地应用，特别是在传染病和成像方面。

【原文出处】

Pillay, T. S. and S. Muyldermans (2021). "Application of Single-Domain Antibodies (“Nanobodies”) to Laboratory Diagnosis." alm 41(6): 549-558.