技术｜核酸分离提取所面对的挑战

对核酸进行分析是一种强大的实验方法，它为基础研究和临床应用提供了对各种生物过程的洞察力。DNA分离（以及RNA分离）是许多现代基因组学技术开发和应用的第一步，它需要没有污染物的高质量起始材料。

复杂，这是我们谈到核酸提取时最重要的问题，也是核心问题。因此，为你的样品或应用选择“正确”的分离方案是很重要的。

基因组DNA提取是许多分子生物学研究和所有重组DNA技术的第一步。该方案涉及到将细胞破碎，并把需要的DNA从样品中其他核酸和细胞成分中分离出来，同时还要保持其良好的状态以便进行下游分析。

有几种提取方法可供选择，从温和的到积极的，如何选择取决于各种因素，如目标DNA、源生物体、起始材料的类型和质量以及应用。所有的方法都有三个共同的步骤：裂解、去除污染物和DNA回收。

细胞裂解包括化学、机械或酶法破坏细胞膜和蛋白质的变性。具体方法取决于你的起始材料。细菌、哺乳动物细胞、植物细胞和人体组织都可能需要一个稍微不同的方法。

温和的裂解方案可能涉及使用洗涤剂，如十二烷基硫酸钠（SDS），或酶来打破细胞膜；积极的裂解方案可能采取均质化的形式来物理地打破细胞壁。

你可以使用基于溶液和固相的方法，将DNA从不需要的裂解碎片和潜在的污染物中分离出来。例如，苯酚-氯仿DNA提取法将水溶性DNA和变性蛋白质分离到不同的阶段。这很便宜，但速度很慢，而且有可能出现影响下游应用的苯酚残留。

固相萃取将DNA结合到柱子或珠子表面。例如，二氧化硅树脂或二氧化硅包覆的磁珠，使用混沌盐来破坏氢键并结合核酸，使污染物被洗掉。寡核苷酸涂层树脂也可以增加一定程度的特异性，但柱子套件的成本会迅速增加。

下游应用需要你的DNA有一个合适的溶剂和浓度。通常情况下，这只是用乙醇沉淀你的DNA，清洗，然后重新悬浮在适当的缓冲液中。对于固相方法，首先需要调整缓冲液的pH值或盐浓度以释放核酸。

5.1、培养的哺乳动物细胞和组织

培养细胞相对容易用渗透压或洗涤剂处理来裂解，而从组织中分离DNA需要打破细胞外基质，而不仅仅是细胞膜。这通常需要均质化，然后进行硅胶柱（如genomicPrep试剂盒）或基于磁珠（如SeraSil-MagTM）的纯化，或者不太有利的苯酚-氯仿提取。

使用福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的组织在临床应用和一些研究中很常见。它对保存组织结构非常好，但会引入各种DNA损伤，影响深远。也就是说，由于分离出的DNA的质量直接影响到检测结果，阳性样本可能仅仅因为提取不当而被忽略。

5.2、血液

从血液中提取DNA的一个挑战是DNA数量的变化取决于血液的成分。红细胞不含DNA，所以全血中每个细胞的DNA含量比白膜层或骨髓来源的部分少得多。

血液凝固也带来了挑战，凝结会阻止有效的样品消化，一些抗凝剂会干扰PCR扩增。

5.3、细菌

在从细菌中提取DNA方面，革兰氏阳性和革兰氏阴性样本之间存在差异。革兰氏阳性样本通常需要溶菌酶处理，以消化细胞壁中较高的肽聚糖，而对于革兰氏阴性样本，简单的渗透压冲击可能就足够了。

两种类型的DNA都不可能很少，通常使用快速方法，如碱性提取和硅藻土，来提取DNA。这两种方法都很可靠，但碱性提取本身可能无法提供最高的纯度，而硅藻土的成本可能很高。

5.4、植物材料

植物细胞可以嵌入坚韧的基质中，其细胞壁由糖类和纤维素组成，很难打破。基于溶剂的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）提取方法对于植物材料来说是很常见的，但这是一种积极的方法。它使用苛刻的化学品，很费力，而且经常需要进一步清理和优化不同的样品和应用。

磁珠因其多功能性和易用性，为传统的分离和清理方法提供了一个很好的替代方案。它们不需要对可能已经搅拌过的样品进行额外的离心，提高了回收较大片段的可能性，而且可以扩大规模，比色谱柱具有更高的结合能力。

使用磁珠很简单，不需要危险的溶剂，释放DNA或RNA只需调整缓冲液的特性（图1）。这种简单性也使得磁珠很适合在高通量应用中实现自动化。

图1 | 用于核酸分离的磁珠的原理。