技术｜Cas9或Cas12？如何挑选合适的CRISPR系统

CRISPR基因编辑技术的应用是不断扩大的。快速搜索一下提到CRISPR的最新出版文献，就会发现它在植物基因组工程、生物传感、基因组筛选、治疗遗传疾病和诊断感染方面的应用。

CRISPR系统的多功能性大部分来自CRISPR相关蛋白或Cas蛋白，即识别和切割特定DNA片段的分子剪刀。

自从最初发现后来被称为CRISPR的东西以来，已经发现了6种主要类型和超过22种亚型的Cas蛋白。

也许最著名的是Cas9，这是最初的基因编辑酶，其变革性的可编程能力在2012年由Emmanuelle Charpentier和Jennifer Doudna首次描述。Cas12是CRISPR万神殿的一个较新成员，因其在诊断方面的潜在用途而受到特别关注。

但是，Cas9和Cas12之间的主要区别是什么，以及你如何决定哪个适合你的研究？

Cas9蛋白存在于包括化脓性链球菌在内的几种菌株中，这种双RNA引导的DNA内切酶最初是为了切割入侵的外来DNA而进化的。

在自然界中，Cas9需要两种RNA来识别和切割其目标，一种叫做CRISPR RNA（crRNA）的靶向RNA，它是目标DNA的副本，还有一种叫做反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）的结构组分，它与crRNA形成正确组装和与Cas9联合所需的复合物。

在他们具有里程碑意义的论文中，Charpentier和Doudna的团队将这两种RNA结合成一个单一的引导RNA，它可以指导Cas9在DNA中进行序列特异性切割。

他们还表明，引导RNA的核苷酸序列可以被编程为针对任何DNA序列进行切割，形成了基因编辑系统的基础，这为他们赢得了2020年的诺贝尔奖。

当到达目标时，Cas9在DNA中进行双链切割，使得能够插入、删除或修改附近DNA的特定区域。

自2012年发现Cas9以来，科学家们已经取得了许多进一步的发展，包括更准确的变种。例如，Cas9-HF1（或“HiFi”）被设计用来减少非特异性接触，据报道其靶向切割准确率超过99.9%。

尺寸也得到了优化，2015年在金黄色葡萄球菌中发现了一个较小的Cas9版本。这种较小的Cas9比来自化脓性链球菌的原始Cas9小1kb以上，可以被包装到一个腺相关病毒（AAV）载体中，在尺寸重要的应用中可以代表一个有用的替代方案。

Cas9提供高保真的基因组编辑，对研究和商业应用特别有用。该技术已经在世界各地的实验室投入使用，发表了近2万篇科学论文，并促进了从转基因作物和牲畜到食品添加剂和美容产品等新产品的开发。

然而，Cas9并不是唯一的Cas，2015年，Cas12在Acidaminococcus和Lachnospiraceae家族的细菌中被发现。这个较新的Cas已经被大肆吹捧--但它与Cas9有什么不同？

Cas12是一种单一的RNA引导的内切酶，这意味着它处理自己的引导RNA，因此只需要crRNA进行靶向，这使得它的整体体积比Cas9小。为Cas9或Cas12设计靶向crRNA的能力是非常直接的，也是这些系统在基因组编辑中的简单性和广泛使用的关键。

据广泛报道，Cas9的切割效率比Cas12略高，但是，两者的切割效率都比其他基因组编辑系统，如TALENs和锌指，要好。Cas9留下一个钝端切割，而Cas12留下一个5'悬垂，但这似乎对可以完成的编辑类型没有意义的影响。

一个重要的区别是，Cas9和Cas12识别不同的PAM序列，所需裂解位点旁边的一段短的靶向DNA，对每个系统的整体效用有广泛的影响。

Cas9只需要与其目标相邻的“GG”序列，而最初的Cas12则需要“TTTV”序列（其中V为A、C或G），Cas12的较新衍生品只需要“TT”。

然而，大多数哺乳动物的基因是富含GC的，这意味着不难找到必要的GG来将Cas9定位于一个特定位置。相比之下，典型的Cas12富含TT的PAM在细菌基因组中更为丰富，因此在哺乳动物基因组中的靶向能力更为有限。仅仅基于这一点，许多研究人员发现Cas9在哺乳动物系统中的使用更为灵活。

然而，研究人员已经发现了Cas12的一个独特属性，它适合于基因组编辑之外的另一种应用：对单链DNA的非特异性切割。这种能力通过检测来自病毒和癌细胞等来源的少量DNA，已被转化为DNA诊断的有力工具。

虽然Cas12可能在诊断等某些应用中拥有更大的潜力，但它处于比Cas9更早的发展阶段，可能缺乏精确基因组编辑所需的一些准确性。

作为最初的、特征最明显的CRISPR效应核酸酶，Cas9拥有更长的研究历史、出版记录和更大的投资。由于这个原因，Cas9“开箱即用”，更适合于需要准确性和可靠性的商业和研究应用，特别是在哺乳动物应用中。

表1 | Cas9与Cas12的区别？

作为一项专利技术，CRISPR的任何商业用途，从内部研发一直到市场，都需要获得专利持有人的许可，这里就变得有点混乱了。

CRISPR不仅因其科学潜力而迅速获得关注，而且媒体对夏普蒂尔、维也纳大学和加利福尼亚大学（合称CVC）与麻省理工学院的布罗德研究所之间围绕该技术的各种专利纠纷也给予了大量关注。这两个团体都对CRISPR技术的各个部分拥有知识产权（IP），必须获得许可才能进行商业化使用。

2022年2月，美国的最新裁决支持布罗德团队在真核细胞中具体使用单向导CRISPR/Cas9系统方面拥有优先发明权。这引发了戏剧性的头条新闻和社交媒体的讨论，可能导至一些人错误地认为CVC对CRISPR/Cas9技术不再拥有任何专利权。

事实上，这一最新裁决对CVC在美国获得的任何基础专利都没有影响，这些专利涵盖了CRISPR/Cas9在所有环境中的组成和使用，包括真核细胞，CVC在包括欧盟、中国、日本和其他国家在内的80多个国家拥有这些专利。

CVC保留了40多项美国专利的权利，这些专利涵盖了CRISPR/Cas9基因编辑的一系列组成和方法，并拥有CRISPR/Cas9的DNA修饰方法的欧洲专利，涵盖了在细菌、植物、动物和包括人类在内的脊椎动物细胞中的使用。

因此，CRISPR/Cas9的大多数商业研究和应用可能需要从CVC的许可开始，也可能需要布罗德的单独许可，这取决于地理区域和具体使用情况。

相比之下，尽管最近围绕Cas9专利权出现了一些骚动，但Cas12的许可和专利情况甚至更加复杂和不透明。截至2020年，Cas12在全球有899个专利族，其使用的许可情况仍然存在争议，完全不清楚。

一些团体公开宣称已经创造了不受任何限制的Cas12衍生物，但考虑到与Cas12的结构相似，以及在这一领域申请的专利数量不断增加，希望在知识产权领域分一杯羹，这些宣称似乎充其量也是令人怀疑的。

CRISPR技术已经彻底改变了生命科学，为有助于改变世界的新技术提供了新的可能性。反过来，这也引发了从灵活的生物技术初创公司到大型成熟组织的商业兴趣，这是可以理解的。选择正确的系统并获得适当的许可是探索这个充满机遇的新世界的重要第一步。