IVD技术丨Lab-in-a-fiber光流控技术或可高通量检测新冠病毒

微流控技术是生物学家在高度控制的微型系统中操纵和分析生物样本的有力解决方案。微流控芯片采用亚毫米通道系统，从连接的储液罐中提供液体。芯片设计和并行化有助于在单个设备中快速、多模式地处理和访问分子或细胞，并与自动化大规模生产一起，实现了诊断、环境分析和生物科学的商业用途。液滴微流体技术是一种微流体技术，它利用离散的水液滴，通过不互溶油分离，并通过表面活性剂稳定，作为微型样品容器。单分散液滴可以在微流控系统中生成和检测。可以超高通量（>1000滴每秒）对纳米至皮升样品包中的单个细胞或分子进行数字检测和分析. 液滴已在体外被用于封装细菌和细胞等多种靶点，并进行高度敏感的病毒检测。

液滴分割将单个样品分成数千个液滴，这些液滴在环境中相互隔离。一方面，在采集样本时对其进行分区，可以在原位、活体内对样本材料进行高分辨率的时间和空间分析。另一方面，将单个稀释样品分成多个液滴，每个液滴包含单个目标分子或缺少目标分子，可以对扩增的分子物种进行数字检测，显著降低了对光学检测器的需求，例如液滴数字PCR和数字液滴LAMP。所谓的光流控设备是一种将关键的微流体样品处理能力和光学功能协同结合起来的方法，为生物和化学传感开辟了有希望的途径。已建立的光学技术，如荧光激活液滴分选、光学显微镜或激光诱导荧光（LIF），可以整合到微流控芯片中。

将微流控能力直接集成到光纤和毛细管中，是光流控的一种新兴的方式。光纤具有一系列特性，包括灵活性、化学和生物惰性、易于光耦合。此外，它们在全世界的广泛使用，从电信到传感和医学成像领域的众多领域带来了高耐受性和标准化生产，可以组装成具有精确通道尺寸的低成本光流控设备。

自2019年末开始，SARS-CoV-2或COVID19大流行代表了一个重大的全球健康挑战，并继续产生深远的社会和经济后果。新冠大流行强调了对高收入和低收入国家进行全球可部署、快速和可扩展的生物分子检测的必要性。针对SARS-CoV-2持续感染而开发的检测包括快速抗原测试（检测鼻咽拭子样本中是否存在关键病毒蛋白）和核酸测试（扩增并检测鼻拭子、喉拭子或口腔拭子中的病毒遗传物质）。其中，核酸扩增试验有望提供比快速抗原试验更高的灵敏度和潜在更高的特异性。

近日，来自瑞典荷兰的几个研究团队在Scientific reports中发表了一篇题为“A Lab-in-a-Fiber optofuidic device using droplet microfuidics and laser-induced fuorescence for virus detection”的文章，在这项文章中，研究团队开发了一种液滴微流lab-in-a-Fiber设备，可用于执行基于数字LAMP的快速核酸扩增测试的生物测定功能。此设备包含了两个关键步骤是：样品材料的液滴封装和通过LIF原位检测光学指标。研究团队使用100μM至10 nM范围内的一系列荧光素稀释溶液对其进行测试。此外，还使用此设备展示了基于预扩增RT-LAMP的核酸扩增SARS-CoV-2检测的结果。由此证明了集成的光流控设备在此类核酸扩增测试的诊断相关荧光检测系统内的作用。

图片来源：Scientific reports

Lab-in-a-Fiber设备由纤维和毛细管制成，包括两个模块，其作用如下：通过流动聚焦产生液滴；以及光学探测。Lab-in-a-Fiber设备通过近端光耦合和通过注射泵施加负压运行，允许远端样品装载。

液滴生成模块。

五孔毛细管中心孔的90μm/125μm ID/OD毛细管用作分散/水相入口，第二根90μm/125μm ID/OD毛细管用作连续/油相入口。五孔毛细管的中心孔注入分散相，外部四孔注入连续相油。靠近五孔毛细管出口的另外一根毛细管迫使油进入分散相路径，通过流动聚焦促进液滴生成。

液滴检测模块。

Lab-in-a-Fiber设备使用潜望镜纤维在内部进行光学检测。光通过光纤尖端的侧面传播，类似于潜望镜。此外，液滴检测模块还被设计成可以独立测量每个液滴的荧光，提高检测效率。

Lab-in-a-fiber设备概述。

图片来源：Scientific reports

与纤维耦合的488 nm激光激发液滴。激发光通过激发滤光片，从二向色镜（DM）反射到第二个端口（L2），该端口用于将光耦合到lab-in-a-fiber设备中。收集的荧光通过二向色镜（DM）和发射滤光片（Em滤光片）。消色差聚光透镜（L3）将光松散地聚焦到硅光电倍增管（SiPM）上。SiPM信号通过用作1 kHz低通滤波器的低噪声前置放大器耦合到示波器。

用于操作lab-in-a-fiber设备的光学和硬件

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研究团队选择了荧光素（fluorescein）作为合适荧光替代物。并使用荧光素稀释液组浓度为：100μM、10μM、1μM、500 nM、100 nM、10 nM、1 nM。

荧光素稀释液通过光纤实验室设备进行分析，并收集每组稀释液约20000滴的数据。计算每个浓度的每个液滴组的振幅和标准偏差。测试结果显示，每个液滴组都可以进行区分，并确定了10 nM荧光素的检测限（LOD）。并且观察到的液滴荧光强度差异归因于荧光团浓度，而不是在这种缓慢的液滴状态下液滴速度的变化。

使用荧光素稀释液检测lab-in-a-fiber设备

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为了证明lab-in-a-fiber设备可以用于生物学分子检测，研究团队对预先扩增的阳性和阴性SARS-CoV-2 RNA RT-LAMP样本进行了测试。室温下，负（9.7 mV±0.2）和正（14.6 mV±0.7）RT-LAMP样品的平均荧光值存在明显差异，信噪比（SNR）定义为正液滴荧光值与负液滴荧光值之比，为1.5。当在65◦C时检测同一样本， 观察到负（4.0 mV±0.2）和正（14.5 mV±0.5）RT-LAMP样本的平均振幅之间的差异增大，SNR为3.6。在室温下，引物二聚体的产生更为显著，因此观察到的群体分辨率的增加是由于65◦C时阴性样本的背景荧光减少。

检测通过RT-LAMP体外合成的SARS-CoV-2 RNA片段

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微流控技术在过去20年中迅速崛起，并在生命科学和环境监测等领域得到了广泛的应用。虽然连续流动式微流控无处不在，但分段式微流控或液滴微流控有几个吸引人的特点。液滴可以以高通量方式进行独立操作和分析。纤维是一种有趣的替代形式，具有增强光耦合的关键优势。在此，研究团队展示了在单纤维光流控微实验室（lab-in-a-fiber）中产生单分散液滴的技术。并且将液滴微流控与激光诱导荧光（LIF）检测相结合。激光诱导荧光具有灵敏度高、检测限低、响应时间快等特点，是实时检测的一种有吸引力的检测方法。我们使用成熟的荧光基团荧光素来表征光流控微实验室，并确定产生的～0.9 nL液滴。研究团队提供了一系列荧光素浓度的表征数据，确定了10 nM荧光素的检测限（LOD），它与许多传统的芯片上微芯片平台相当。最后，研究团队通过检测逆转录环介导的等温扩增（RT-LAMP）产品的背景下用光流控微实验室进行了COVID-19诊断。该设备展示了光学FBER和毛细管的传统优势，即生物和化学惰性、与传统光学的集成，以及向体内用例发展的潜力，并且代表着向护理点液滴数字RT-LAMP平台发展的一个进步。