“收购杀手”罗氏还没有放弃纳米孔测序！正积极招聘推动进入产品化阶段

我是建设者在去年发表了文章提出“我们是不是看不到罗氏发纳米孔测序仪了？”，跟很多人一样，看不清楚罗氏在纳米孔测序开发上语焉不详的未来。然而，近期罗氏似乎又一次加满了油，继续冲刺纳米孔测序的开发和产品化。

搜索罗氏正在招聘的职位可以发现，在过去的两个月中，罗氏密集发布了近20个跟纳米孔测序相关的工作机会，招聘力度比以往都大，提示了罗氏持续开发纳米孔测序的决心。这些工作机会以美国圣克拉拉和西雅图为主，其中罗氏诊断分子解决方案（Roche Molecular Systems）包括测序仪器的研发就集中在圣克拉拉，而西雅图则是罗氏2020年收购Stratos Genomics（斯特拉托斯）之后所保留的工作地点。从这些招聘所提示的信息上我们可能窥探罗氏正在开发的纳米孔测序的技术路线。

从招聘来看，罗氏正在从概念验证过渡到产品化阶段，招聘的岗位多集中在强调其纳米孔测序平台上开展测序工作流程所需设备的界定、设计、开发、集成和验证，包括样本制备平台、耗材、半导体/芯片/晶圆/电路、替代核苷酸(X-NTPs)、控制软件及数据端解决方案等，涵盖了多个关键的环节。这提示罗氏纳米孔测序已经完成了概念验证，开始为产品原型做准备。当然早期内部研究开发和收购所带来的概念/设备都构成了这一步跨越的前提。

在之前的文章中，我们也提到了罗氏所收购的Genia和Stratos是两套不同的化学体系，这两条路线也很难融合协同。而现在看起来，罗氏似乎放弃了Genia的nano-SBS和核苷酸标签的化学体系，转向了Stratos的扩展测序Sequencing by eXpansion (SBX) 技术路线。罗氏的官方网页也只留下介绍SBX的纳米孔测序技术。

Stratos被收购以后，一些核心人员都还留在了罗氏，以开发化学体系为主。SBX以Xpandomer为核心的化学体系回归了单一纳米孔传感的思路，整个化学体系也不需要额外的控速蛋白，延续了Genia多聚物标签放大核苷酸特异信号识别的思路，加强了信号读取的效率和准确度。从历史上来看，修饰核苷酸然后筛选匹配高效DNA聚合酶的操作还是比较有效的。在某种程度上，Stratos 纳米孔测序的这个思路与PacBio SMRT的方式有些类似，只是将天然核苷酸的识别通过Xpandomer包含的报告组分标记放大，而纳米孔只是作为特征信号的识别机制，如ZMW识别特定的核苷酸的荧光标记一样。理论上，这样的体系对于短片段和长片段都适用，但无论如何由于互补合成这一步骤，丢失掉了模版链甲基化等表观修饰的原始信息。此外，从罗氏专利申请来看，其在模版制备上可能也会采用成环扩增的方式进一步增加原始读取信号的准确度。

Genia的Nanopore-SBS技术

Xpandomer纳米孔传感识别放大的碱基信号

放弃了Nano-SBS的技术路线，折腾了这么多年，Genia到底为罗氏留下了啥？抛开化学体系不言，包括改造纳米孔、蛋白工程、如何铺膜、如何精确插入纳米孔等，罗氏/Genia这几年积累了相应的专利技术和经验，除此之外，一定是精细电极微阵列、控制电路设计及CMOS芯片开发方面的经验。2016年的文章发表时，使用的Genia CMOS芯片只有264个独立的电极，而罗氏在GPU Technology Conference 2018的演讲中提示可能已经实现了上百万的孔道芯片设计。纳米孔及芯片方面的开发经验恰恰是Stratos所需要更多补全的。

所以，最终的罗氏纳米孔测序仪原型可能是什么样子？我猜就是Stratos的Xpandomer合成链测序+Genia的纳米孔/脂质膜/ CMOS芯片/电路（一百万级通道），DNA模版在合成Xpandomer之前也可以经过（成环）扩增、富集、UMI pooling等NGS常见的方式进行操作。这样的设置可能在数据产出上跟Sequel一代差不多，但应该仪器体积达到可便携的水平（如鞋盒大小？），数据准确率是不是能达到现在ONT所发布的Q20水平?但不管是Xpandomer的合成纯化，膜上反式插入纳米孔，以及如何精确引导扩展后的合成链进入纳米孔等方面，罗氏应该都还有很多工作要做。

罗氏之前在一些场合表示其测序仪的开发以临床应用为主，而不是主打基因组组装等科研市场，而临床应用上罗氏的野心一定是提供端到端的解决方案。罗氏在肿瘤检测方面除了Foundation Medicine这样的市场主力之外，也推出了AVENIO ctDNA 分析试剂盒和自己的生物信息学分析软件。如果上面讲的罗氏纳米孔技术路线成真，那么我们将看到更多类似Stratos在2018年ASHG上概念证明工作所展示的在其纳米孔平台上实施罗氏的肿瘤基因检测方案。去年罗氏推出了AVENIO Edge自动文库制备仪器，而在最近的一个招聘职位里，罗氏提到正努力在未来几年里将新型罗氏测序仪 AVENIO Central 推向市场。

Stratos在2018年ASHG上所展示的纳米孔测序工作流程

果真这样的话，我们可以预见将在今年底或者明年初听到罗氏纳米孔测序的更多进展，可能在未来三五年里期待罗氏纳米孔测序仪面世。

到那个时候，尘封了多年的罗氏野心勃勃的测序故事将再次被人们乐道。