多家顶尖大学填补精准癌症医学缺口——如何发现有临床意义的基因融合

癌细胞中的基因融合是一类分子畸变，主要由基因组易位、插入、缺失或染色体反转引起。相当一部分融合基因驱动肿瘤发生和/或促进肿瘤进展，如BCR-ABL1、ETV6-NTRK3和TMPRSS2-ETS。由于其肿瘤特异性表达和驱动肿瘤病理生理学的能力，作为驱动因素的融合基因代表了具有巨大诊断和治疗潜力的靶分子。随着下一代测序技术的进步，尤其是通过癌症基因组图谱（TCGA）和国际癌症基因组联盟（International Cancer Genome Consortium）全基因组泛癌症分析的努力，在所有癌症类型中检测到的融合基因数量已从数百个增加到>35000个。然而，人们对这些癌症融合基因的功能影响和临床相关性仍知之甚少，这代表着实施精确癌症医学的关键知识缺口。

目前的研究主要集中在一小部分在患者肿瘤中检测到的高度复发的基因融合，以获得详细的功能和机制特征。虽然这是一种合理的做法，可以确定可以最大限度地发挥潜在临床影响的靶点，但这种方法导至许多罕见的基因融合尚未得到探索。此外，传统的实验研究只能以耗时且昂贵的方式研究少量基因融合，不足以满足临床环境中决定治疗方案的需要。这在很大程度上是由于在敏感和稳健的功能分析中难以创建、表达和描述大量特异性融合基因。

近日，一群来自美国多家大学包括哈佛大学在内的研究团队在SCIENCE ADVANCES上发表了一篇题为“A functional genomic approach to actionable gene

fusions for precision oncology”的文章，在这项研究中，研究团队开发了一种有效的功能基因组学方法来描述在细胞中基因融合的后果，并将其应用于大量融合基因。研究团队进一步深入分析了受体酪氨酸激酶（RTK）-RAS信号通路中涉及的融合的功能后果和药物敏感性。这种方法展示了一种填补基于测序的融合检测和基于靶点的临床行动之间差距的潜在方法。

为了确定临床可使用的融合基因以实施精确肿瘤学，研究团队开发了一种有效的功能基因组学方法来评估基因融合的功能影响，并将其应用于大规模TCGA患者样本中检测到的融合基因。首先，从33种癌症类型的11000名TCGA患者中收集了约35000个基因融合事件。考虑到它们的相关途径和相关伙伴基因的潜在可药物性，研究团队选择了110个基因融合（主要来自TCGA列表，另一组来自MD-Anderson患者）。第二，使用gateway多片段重组技术生成融合基因质粒。通过对相应质粒进行直接测序来验证融合构建体的质量。第三，对于每个融合基因，在Ba/F3*和/或MCF10A等细胞系中进行体外分析，评估其对细胞活力的影响。对于选定的候选融合基因，还进行了异种移植肿瘤检测，以评估其体内致瘤活性。最后，对于上述确定的阳性中选者，还需要进行药物反应分析，以确定其治疗意义。

*Ba/F3是一种依赖白细胞介素-3（IL-3）进行生长和增殖的小鼠前B细胞系，但在发生致癌事件时，它很容易转化为IL-3独立性，因此广泛用于检测致癌事件。

RTK-RAS通路在多种癌症类型中经常被破坏，据估计，多达40%的肿瘤在RAS家族的基因中存在异常。研究团队分析的近一半病例（42例融合）至少有一个来自RTK-RAS途径的伙伴基因，因此，他们将重点放在该途径上进行深入分析。在TCGA PanCanAtlas数据集的基础上，对RAS通路272个基因的基因融合进行了系统分析。在9105例TCGA肿瘤中，1289例（14.2%）肿瘤至少存在一例这种融合。RAS通路融合率最高的是肉瘤（平均每个肿瘤0.8个RAS通路融合）、卵巢癌（0.6个）和胶质母细胞瘤（0.6个），最低的是肾嫌色细胞癌（0.02个）和胸腺瘤癌（0.02个）。297例肿瘤含有一个或多个RAS途径融合，且RAS途径成员未发生突变。这些肿瘤携带已知癌基因的潜在驱动融合，如ALK（TPM1-ALK）、FGFR3（FGFR3-ELAVL3）、BRAF（MACF1-BRAF）和AKT3（ACV2RA-AKT3、ZEB2-AKT3），以及可能影响RAS抑制剂（RASAL2和SPRED2）和RAS调节的肿瘤抑制基因（PTEN、RB1、TP53、RAD52和FANCC）功能的融合。结果表明，这些融合通过激活RTK-RAS通路在肿瘤的发生和/或维持中发挥作用。

如图，在TCGA患者队列（n=9105）中分析的42个基因融合的频率汇总。具体而言，FGFR（五个FGFR2和两个FGFR3融合）的融合频率最高（n=44），在13种癌症类型中检测到；而NTRK融合（两个NTRK2和三个NTRK3融合；n=12）发生在五种癌症类型中。在这些基因融合中，ALK、BRAF、RET和FGFR是最常见的伙伴基因，每一个都有五个融合。

ALK基因融合已在多种实体瘤中报道。在EML4和其他ALK基因融合的情况下，5′卷曲螺旋结构域二聚化导至ALK的酪氨酸激酶功能激活。除了已被发现的在肺癌和其他类型的癌症中的ALK-EML4重排外，研究团队发现膀胱癌中TPM1-ALK融合。

研究团队在Ba/F3细胞活力测定中评估了TPM1-ALK基因融合的功能效应。结果显示，TPM1-ALK使Ba/F3细胞的存活和增殖显著提高了70倍（P<10−4）。与融合基因的表达相比，全长的TPM1和ALK表达均不能促进Ba/F3的存活和增殖。

接下来，研究团队检查了TPM1-ALK对ALK抑制剂的反应。与对照细胞相比，表达TPM1-ALK的Ba/F3细胞对克唑替尼（crizotinib）[IC50=16.5 nM]表现出显著的敏感性，克唑替尼是一种临床上用于治疗ALK阳性肺癌患者的ALK激酶抑制剂。因为ALK融合的细胞系增加了ALK的表达，导至有ALK融合的细胞系对ALK抑制剂敏感性明显更高。

总的来说，这些结果强调ALK融合是对ALK抑制剂反应的有效的预测标记物。

之前的研究已经报道了几种BRAF（B-Raf原癌基因，丝氨酸/苏氨酸激酶）和RAF1（Raf-1原癌基因，丝氨酸/苏氨酸激酶）基因与黑色素瘤、甲状腺癌和前列腺癌中的与其它基因的融合。研究团队分析发现BRAF/RAF1与多个伙伴基因融合，其中包括黑色素瘤中已知的基因融合TAX1BP1-BRAF和TRAK1-RAF1。研究团队从TCGA队列中选择了另外三种BRAF/RAF1融合，它们保留了完整的蛋白激酶结构域：CLCN6-RAF1、CDC27-BRAF和ATG7-BRAF。

Ba/F3细胞的活力测定评估了这些融合基因的功能效应。结果显示，这些融合基因使Ba/F3细胞的存活和增殖显著提高了30-142倍（P<10−4）。Ba/F3中的BRAF融合活性与表达致癌BRAFV600E的细胞相似，BRAFV600E是一个明确的致癌事件，在46%的黑色素瘤样本中发现。RAF1和BRAF融合表达，与BRAFV600E相似，增强了MAPK信号。

接下来，研究团队检查了RAF1融合物对MAPK抑制剂的反应，结果显示对MAPK激酶（MEK）抑制剂曲美替尼具有显著的敏感性（IC50，CLCN6-RAF1=1.223 nM和TRAK1-RAF1=0.9588 nM）。具有内源性RAF1融合的细胞系对曲美替尼更敏感，这也表明RAF1融合可以为曲美替尼和其他可能的RAS/MAPK途径抑制剂可能获益的预测标志物。所有三种BRAF融合使Ba/F3细胞对曲美替尼敏感（IC50，TAX1BP1-BRAF=0.9107nm，CDC27-BRAF=0.6334nm，ATG7-BRAF=1.148nM）。这些结果表明，RAF1和BRAF融合在黑色素瘤和其他肿瘤谱系中代表了一类关键的可操作事件。

成纤维细胞生长受体基因FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4的致癌重排已有报道。在TCGA队列中的20种癌症类型中发现了FGFR基因融合，包括WHSC1L1-FGFR1、FGFR2-BICC1和FGFR3-TACC3的融合。与之前的研究一致，FGFR2-BICC1和FGFR3-TACC3在Ba/F3活性测定中显示出显著的激活效应。

研究团队使用colony assay评估了MCF10A细胞中FGFR3-ELAVL3融合的驱动潜能。结果发现,与致癌的PIK3CAH1047R对照相似，FGFR3-ELAVL3的表达导至colony形成显著增加（12倍，P=5×10−4），且激活了MAPK途径。

研究团队提出了一个综合的证据级别分类系统，该系统由四个级别组成。4级（L4）：融合存在证据，通过肿瘤测序数据确定的基因融合；L3：基于相关性的证据，融合显示与药物敏感性有显著相关性，例如RAF1融合到曲美替尼；L2：功能证据，在体外和/或体内对肿瘤生长或药物反应有显著影响的融合，例如TAX1BP1-BRAF1；L1：临床证据，与患者数据中预测治疗反应的证据相融合，例如肺癌中的EML4。水平越低，根据肿瘤中确定的特定基因融合治疗患者的可能性就越大。从患者肿瘤的RNA测序数据中识别融合候选基因到完成体外细胞活力和药物敏感性检测的整个过程可以在短短7周内完成。

融合基因代表了一类有吸引力的治疗靶点。已经在癌症患者中发现了数千个融合基因，但其中大多数的功能后果和治疗意义仍在很大程度上未知。在这里，研究团队开发了一种功能基因组学方法，包括有效的融合重建、敏感的细胞活力和药物反应分析。应用这种方法，研究团队描述了在癌症基因组图谱患者样本中检测到的约100个融合基因的特征。将重点放在RTK-RAS途径中，发现了一些能显著影响相关药物敏感性的激活融合。研究团队提出了一个综合的、基于证据级别的分类系统，以系统地优先考虑基因融合。这个研究重申了临床上迫切需要结合类似的功能基因组学方法来描述基因融合，从而最大限度地发挥基因融合在精确肿瘤学中的作用。