NGS颠覆传统MSI检测，FDA批准F1CDx作为K药在MSI-H泛实体瘤中的伴随诊断！

近年来，随着PD-1/L1等免疫检查点抑制剂（ICIs）的出现，微卫星不稳定性（MSI）状态已成为临床免疫检查点抑制剂治疗的重要生物标志物。当DNA错配修复（MMR）系统无法正常工作时，可能会导至微卫星不稳定性高（MSI-H）的状态。

2017年5月，帕博利珠单抗（K药）获FDA批准用于后线治疗MSI-H/dMMR泛实体瘤及结直肠癌患者；¹ 2017年7月，纳武利尤单抗（O药）获FDA批准用于后线治疗MSI-H/dMMR结直肠癌患者；² 2018年7月，O药+Y药获FDA批准用于后线治疗MSI-H/dMMR结直肠癌患者；³ 2020年6月，K药获FDA批准用于一线治疗MSI-H/dMMR结直肠癌患者。⁴ 2021年11月，恩沃利单抗获NMPA批准用于后线治疗MSI-H/dMMR泛实体瘤及结直肠癌患者。⁵ MSI-H已然成为一个成熟的免疫治疗生物标志物并不断获得官方批准，但国内外药物监管机构却没有批准任何的伴随诊断检测产品。

传统的MSI检测方法包括PCR-Based MSI检测法或间接通过MMR蛋白表达-IHC染色法。随着二代测序（NGS）成为肿瘤领域的主流技术，基于NGS的MSI检测方法也在不断涌现。同时，临床对于将不同基因组变异信息（包括MSI分析）整合到一次检测中以充分利用有限组织的检测方案需求正在日益增长。可以说NGS panel（包括MSI分析）完美地贴合了临床的需求。

近日，FDA批准F1CDx（NGS大panel）作为帕博利珠单抗（K药）在MSI-H泛实体瘤中的伴随诊断，用于筛选可能从帕博利珠单抗治疗中获益的MSI-H实体瘤患者。⁶ F1CDx成为了第一个也是唯一一个获批用于（K药）MSI-H检测领域的伴随诊断产品。可以说NGS颠覆了传统的MSI检测。

F1CDx是DNA-based NGS的组织体外诊断产品，可检测324个基因的 SNVs，Indels，CNVs和 Rearrangements 四种变异类型及TMB（肿瘤突变负荷）、MSI（微卫星不稳定性）和HRD（同源重组缺陷：tBRCA阳性和/或LOH-H）三种基因组特征。F1CDx也是目前唯一一个拿下三个泛实体瘤药物治疗生物标志物（NTRK1/2/3，TMB，MSI-H）的伴随诊断产品。

为了确定肿瘤患者的MSI状态，F1CDx采用基于分数（FB，Fractional Based）的MSI算法（FB-MSI）将肿瘤标本分为MSI-H或MSS两类。FB-MSI算法基于对>2000个MSI位点的全基因组进行分析，计算出被改变或不稳定的MSI位点的分数（即不稳定位点得分）。

对于指定的MSI位点，非体细胞等位基因被舍弃，如果剩余的等位基因与参考基因组不同，则该MSI被归类为不稳定的。不稳定MSI基因座的数量除以可评估的MSI基因座的数量，便可得到最终不稳定的MSI位点的分数（即不稳定位点得分）。FB-MSI评分有两个阈值用于将肿瘤标本分为MSI-H或MSS状态。实体瘤样本中FB-MSI评分≥0.0124的患者报告为MSI-H状态，实体瘤样本中FB-MSI评分≤0.0041的患者报告为MSS状态，对于0.0041<FB-MSI评分<0.0124的实体瘤患者，MSI状态则无法确定，患者应考虑再次使用F1CDx进行检测。

此外，F1CDx关于MSI检测状态的验证报告中，提交了一些正交法检测的MSI一致性数据：

1）对159例具有可评估或有效的F1CDx结果的独特实体肿瘤样本进行分析，以确定其与PCR-Based MSI检测方法的MSI-H的一致性。

2）对128例和50例具有可评估或有效的F1CDx结果的结直肠癌和子宫内膜癌样本（随机从FMI临床商业数据库中筛选）进行分析，以确定F1CDx测定的MSI分类（MSI-H/dMMR vs 非MSI-H/pMMR）和MMR蛋白表达-IHC染色法之间的一致性。

FMI为了证明NGS-Based F1CDx的FB-MSI分析准确性，将其与PCR-Based MSI检测方法进行了比较分析。

在186例代表泛瘤种适应症的FFPE标本中，86例选择PCR-Based MSI检测方法，100例选择NGS-Based F1CDx检测方法。在186例FFPE肿瘤标本中，有159例可通过NGS-Based F1CDx方法（97例，失败率为3%=3例）和PCR-Based MSI方法（62例，失败率为28%=24例）检测的有效MSI结果进行评估。

F1CDx的MSI检测结果分为三种，即MSI-H，MSI不确定和MSS。PCR-Based的MSI检测结果也分为三种，即MSI-H，MSI-L和MSS，其中MSI-L和MSS在分析中被认为是阴性结果，MSI-H被认为是阳性结果。最终F1CDx FB-MSI检测方法和PCR-Based MSI检测方法的检测结果显示，MSI-H的PPA（阳性符合率）范围为98.46% ~100%，NPA（阴性符合率）结果的范围较宽，为87.23% ~ 96.81%。

FMI为了继续证明NGS-Based F1CDx的FB-MSI分析准确性，将其测定的MSI分类（MSI-H/dMMR vs 非MSI-H/pMMR）和MMR蛋白表达-IHC染色方法之间进行了比较分析。

FMI从自己的临床商业数据库中随机选择了134例结直肠癌和52例子宫内膜癌患者的样本进行回顾分析。经过F1CDx QC评估后，最终确定了178例样本（包括128例CRC和50例子宫内膜癌样本）具有可评估性或有效性，并以此作为MSI分析数据集。

MMR蛋白-IHC染色方法检测结果分为两种，即dMMR和pMMR，其中dMMR被认为是阳性结果，pMMR被认为是阴性结果。整个样本组的PPA（阳性符合率）和NPA（阴性符合率）分别为85.19%和100.00%。总的来说，评价通过了PPA和NPA的接受标准85%。

FMI为了评估FB-MSI的MSI检测性能，前瞻性的设计了一组来自8种肿瘤类型的65例样本（7例MSI-H样本和58例非MSI-H样本）的回顾性分析。每个样进行批内和批间共36个重复，然后对每个样本进行个性化数据分析。根据MSI评分，将样本分为MSI-H（≥0.0124）和非MSI-H（<0.0124)。

检测结果显示，7例MSI-H样本的MSI评分范围为0.022572 - 0.068244，58例非MSI-H样本的MSI评分范围为0.004294 - 0.000109，65例可评估样本的重复性和重现性为100%。精密度另外进行了44例MSI-H和2例非MSI-H样本的验证。

总的来说，NGS颠覆了传统的MSI检测（PCR-Based MSI检测产品尚未获批用于任何免疫药物的伴随诊断）。此外，由于MSI-H在实体瘤中普遍占比较低，对于多数实体瘤患者，单独进行MSI检测的成本-效益比过低，基于NGS的MSI检测panel可同时检测不同基因组变异信息，在充分利用有限组织的情况下并极大提高分子诊断效率，更贴合临床的需求。

当然，NGS-MSI检测也存在一定的挑战，如MSI位点的筛选及优良的算法和大样本验证，以及在MSI位点重复序列文库构建和测序过程中各实验环节操作因素的影响等。所以，在选NGS-MSI检测的时候尽量选靠谱的大公司，可参考实验室资质（CAP/CLIA认证等）及MSI专利（或注册产品）等。