万字干货，关于PCR基因扩增仪的一切

2022-2-16 16:49| 编辑: 归去来兮| 查看: 3990| 评论: 0|来源: 仪器信息网

摘要: PCR是分子生物学研究极其重要的工具，是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制，即人为创造核酸半保留复制条件，使目的DNA在细胞外完成扩增的过程，它可被看作是生 ...

PCR是分子生物学研究极其重要的工具，是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制，即人为创造核酸半保留复制条件，使目的DNA在细胞外完成扩增的过程，它可被看作是生物体外的特殊DNA复制。

PCR也叫基因扩增仪，主要用于用于科研及临床的基因扩增、定性PCR基因扩增、荧光/酶免终点定量DNA基因扩增、基因芯片等其他基因分析应用的基因扩增等。基因扩增仪适合国内外各种PCR试剂盒传染病类、肿瘤类、科研类。进口基因扩增仪主要由外壳、变温反应腔、散热系统、加热系统、制冷系统、电子控制系统、供电系统、人机界面等各部分组成。基因扩增仪广泛应用于各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。

今天小谱就其发展史、检测原理、结构和大家进行探讨，让基因扩增仪变的更简单。

（如果读完文章您觉得还有哪些想听的知识点小谱没有讲到，亦或是觉得小谱文章中有哪些观点您不太认同，欢迎您积极留言。)

“基因扩增仪”的诞生和发展

核酸体外扩增的设想最早是由Khorana在1971年提出的。“经DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可合成tRNA基因。”

然而当时还没有成熟的基因序列分析方法，也没有热稳定DNA聚合酶以及引物合成操作很困难。这种设想达不到实际的效果。并且在70年代初出现了分子克隆技术，一种克隆和扩增基因的途径被提供了，因此人们遗忘了Khorana的设想。

1983年4月的一个星期五晚上，Kary Mullis开车去乡下别墅的路上,猛然闪现出“多聚酶链式反应”的想法；

1983年12月，Mullis用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的diyi个PCR片段；

1985年，Mullis在Cetus公司工作期间，发明了PCR。Mullis要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼；

1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202 ），Mullis是diyi发明人；

1985年12月20日在Science杂志上发表了diyi篇PCR的学术论文，Mullis是共同作者；

1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法。

根据PCR原理，商业公司在PCR仪的基础功能上不断进行创新和改进。至今，PCR仪已经更新至第三代技术。为方便读者朋友理解，本文将对三代PCR仪的原理、特点、主要厂商及产品、应用领域做一系统梳理。

第一代——标准PCR仪

▲ 标准PCR反应过程

标准PCR仪也叫做终点PCR仪，是指目的基因仅经过预变性、变性、退火、延伸阶段产生大量的核酸序列的PCR仪，PE-Cetus公司推出的世界上第一台PCR自动化热循环仪属于此种。根据PCR退火温度和扩增条件(细胞内/外)，标准PCR又可以分为三类：普通PCR、梯度PCR和原位PCR。

第二代——qPCR(实时定量PCR)

1996年Applied Biosystems(现被赛默飞收购)公司推出了实时荧光定量PCR(RTFQ PCR)技术，并发明了世界上第一台荧光定量PCR仪，开始了从定性到定量的跨越。

实时定量PCR仪是指在PCR反应体系中加入能够指示DNA片段扩增过程的荧光染料(SYBR Green等)或荧光标记的特异性的探针(TaqMan Probe等)，在普通PCR仪设计基础上增加荧光信号激发和采集系统和计算机分析处理系统，形成了具有荧光定量PCR功能的仪器，通过对PCR过程中产生的荧光信号积累实时监测整个PCR过程，再结合相应的计算机软件对所获得的荧光信号数据进行分析，计算待测样品特定DNA片段的初始浓度。

目前根据荧光信号反应样品浓度主要有两种方法：

1.Taqman探针法

探针两端分别为报告荧光基团R和荧光淬灭基团Q，当探针完整时，R发出的荧光被Q吸收，检测不到荧光信号。探针随机结合到DNA单链上，PCR扩增时，探针被水解，R与Q分离，R发出的荧光就会被检测到。每扩增一条DNA链都会生成一个荧光分子。

2. SYBR Green Ι染料法

SYBR Green Ι是一种只有在和双链DNA结合时才会发荧光的染料。在PCR变性时，无荧光产生，到了复性和延伸阶段则能检测到荧光信号。

实时荧光定量PCR仪主要应用于病原体检测、药物疗效考核、肿瘤基因检测、基因表达研究、转基因研究、单核苷酸多态性(SNP)及突变分析等细分研究方向，广泛应用于临床医学检测、生物医药研发、食品行业等研究领域。

第三代——dPCR(数字PCR)

不同于qPCR 对每个循环进行实时荧光测定的方法，数字 PCR 技术是在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集。

数字PCR是一种基于PCR反应(聚合酶链反应)的单分子绝对定量技术。如图1，在数字PCR的过程中：

(a) PCR反应体系(含有荧光染料或探针)被分割为数以万计的均一微液滴，

(b) 其中部分微液滴内会含有一个或多个模板，

(d) 在PCR反应完成后，依次对每个微液滴内的荧光进行检测，

(e) 根据微液滴信号的峰值高度，绘制出微液滴荧光分布的散点图，

(f) 通过合理的荧光分类阈值将微液滴内的荧光强度数字化，判断出其中具有较强荧光的阳性微液滴(图1f中绿色的数据点，称为“1”)和具有较弱荧光的阴性微液滴(图1f中蓝色的数据点，称为“0”)，并通过“1”和“0”的个数来实现绝对定量。因此，与实时定量PCR不同，数字PCR不需要使用标准曲线，即可直接对核酸拷贝数的绝对值进行定量。

▲ 数字PCR原理示意图

最后通过直接计数或泊松分布公式计算得到样品的原始浓度或含量。

迄今为止，目前市面上常见的数字PCR仪器主要有两种，根据微反应的形成原理不同，主要分为 “芯片数字PCR”与“微滴数字PCR”两类。

1.芯片数字PCR

▲ 芯片数字PCR原理图

2.液滴数字PCR

▲ 微液滴数字PCR原理图

液滴数字PCR源于乳液PCR( emulsion PCR) 技术，即将DNA模板与连接引物的磁性微球以极低的浓度(比如单拷贝) 包裹于油水两相形成的纳升至皮升级液滴中进行 PCR 扩增，扩增后的产物富集在磁性微球上，收集破乳后进行测序。通过油水两相间隔得到的以液滴为单位的 PCR 反应体系，比微孔板和 IFC 系统更容易实现小体积和高通量，而且系统简单，成本低，因此成为理想的数字PCR技术平台。

数字PCR技术主要应用于不稳定性分析、肿瘤早期研究、产前诊断、致病微生物检测、癌症标志物稀有突变检测等研究领域，也用于验证NGS中的低频突变、 DNA甲基化检测、突变多重检测等方向。

“基因扩增仪”的结构和原理

1、结构

外壳、供电系统、电子控制系统、加热系统、制冷系统、散热系统、变温反应腔、外壳以及人机界面等共同构成了基因扩增仪。

2、原理

PCR技术的本质是体外核酸扩增，加热使双链DNA解开螺旋，在退火温度条件下引物同模板DNA杂交，在Taq DNA聚合酶，dNTPs，Mg2+和合适pH缓冲液存在条件下延伸引物，重复 “变性→退火→引物延伸”过程至25～40个循环，呈指数级扩大待测样本中的核酸拷贝数。

3、基因扩增的基本要素

基因扩增的基本要素与DNA复制的基本要素是一致的。

①DNA模板：待拷贝的DNA称为模板，它可以是双链DNA也可是单链DNA，Z后扩增得到的产物是双链状态的。

②引物：是DNA复制的先锋，就象结晶过程中的晶核，引导DNA的合成。在PCR扩增中一般使用合成的寡核苷酸作引物。

③DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)：是DNA复制的动力，在dNTP等底物存在时在引物的引导下沿着模板DNA合成互补的DNA链。

④缓冲液：提供DNA合成反应所需的pH，离子强度等环境。

⑤4种单核苷酸：dNTP，提供DNA合成原料。

4、基因扩增仪原理

基因扩增仪是利用PCR技术对特定基因做体外的大量合成，用于以检测DNA/RNA为目的的各种基因分析。

PCR反应一般设置20~40次循环，每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。每一循环的产物作为下一个循环的模板。PCR的扩增效率很高，如果循环次数是30次，那么新生DNA片段理论上达到230拷贝(约为109个分子)。PCR反应每个循环的三个基本反应步骤如下：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA产物解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备;

②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;

③引物的延伸：温度升到72℃左右，DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

“基因扩增仪”的用途和分类

基因扩增仪的用途

基因扩增仪灵敏度高，操作起来简便、快捷，加上对特定基因样本纯度要求低，因而被广泛地运用在以下检测活动中:

1、医学和健康检验机构临床诊断，用于判断检体中是否会表现某遗传疾病的图谱、传染病的诊断以及基因复制。

2、DNA鉴定，常见于司法鉴定领域。

3、临床分子诊断试剂和生物试剂公司药品研发。

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