顺应潮流：仅血浆ctDNA-MRD检测的应用前景！

癌症的MRD检测是一种灵敏且特异的用于监测癌症患者血液中肿瘤源性遗传物质（如ctDNA）相对数量的方法。在这种状态下，患者没有肉眼可见的病灶，但确实存在标准临床影像方法无法检测到但最终会导至癌症复发的微小病灶。

MRD，常称为微小残留病灶（Minimal Residual Disease）。使用“Minimal” （微小）这个词，是因为它在文献和临床专家中更常用。不过，“Minimal”这个词可能具有“误导性”，因为低水平的病变在预后和治疗决策方面也可能具有重要意义。“Measurable”（可测量）一词可更准确地描述残留在病人体内的癌细胞的存在。NCCN指南同时使用了“Minimal Residual Disease”（微小残留病灶）和“Measurable Residual Disease”（可测量残留病灶）两个术语。

此外，可行性研究表明在分子水平上检测多种癌症类型的ctDNA同样具有临床效用，文献和临床专家有时也会使用“Molecular Residual Disease”（分子残留病灶）一词。

近年来，国内外在实体肿瘤中基于ctDNA的MRD评估（ctDNA-MRD）的临床数据和证据越来越多，开启了实体瘤MRD检测的热潮。实体瘤ctDNA-MRD检测的技术流派主要有两大类：

1）Tumor-informed assays（肿瘤知情分析）

对原发肿瘤组织进行测序以鉴定患者的特异基因组变异图谱，然后设计引物定制panel或使用固定panel进行个性化的ctDNA检测分析。

2）Tumor-uninformed assays（肿瘤不知情分析）

也可以称为Tumor-agnostic assays或Tumor-naïve assays，即无需原发肿瘤组织，仅依赖于一组预先选定引物/探针设计的与癌症类型相关的固定panel进行ctDNA检测分析，常在检测ctDNA突变的同时，辅以ctDNA甲基化或片段组学等多组学方法。弥补了肿瘤组织样本不足或监测位点不足或TAT过长等问题。

Tumor-informed assays的技术策略更符合大众的认知，在保证高特异性的前提下，可通过监测多位点的sample-level（样本水平）进一步提高其灵敏度，技术门槛相对来说不是特别高。Tumor-uninformed assays的技术策略更类似于早筛，通过提高site-level（位点水平）检测灵敏度并辅以ctDNA甲基化或片段组学并结合机器学习算法进一步提高其灵敏度和特异性，技术门槛相对来说较高。

2021年4月29日，《Clinical Cancer Research》在线发表了“仅使用血浆ctDNA检测结直肠癌患者微小残留病灶（MRD）”的文章，首次公开了Guardant Reveal的研究数据：MRD检测灵敏度达到91%，特异性达100%，这些发现支持了仅血浆ctDNA-MRD检测（Tumor-uninformed assays）的潜在临床应用。¹

2021年8月13日，《Clinical Cancer Research》在线发表了“顺应潮流：仅血浆ctDNA-MRD检测的应用前景”的文章，在这里研究者们讨论评估了仅血浆ctDNA检测MRD的能力，以及将甲基化整合到ctDNA检测的潜在好处。²

Parikh及其同事¹ 和Taieb及其同事³ 讨论了仅血浆ctDNA-MRD检测在结直肠癌（CRC）患者中的潜在临床应用。

▲ ctDNA甲基化和突变在两项研究中的应用比较（Parikh和Taieb）

结直肠癌（CRC）的治疗仍然面临着一个挑战，即相当多的CRC患者因早期疾病复发而过早死亡。尽管临床采用了标准的辅助治疗，但高风险IIIC期CRC患者的5年生存率也仅有53%，究其原因是没有发现影像学上未检测到的微小残留病灶（MRD）。⁴

目前，仍迫切需要准确确定哪些患者术后存在MRD，以帮助指导减少或增加辅助治疗，并增加治愈的可能性，同时最大限度地减少不必要治疗的相关毒性。

在过去的几年里，我们对ctDNA在CRC诊断和预后中的应用有了广泛的了解。目前，基于ctDNA的MRD评估正广泛应用于癌症的治疗中。

ctDNA是由肿瘤DNA的短片段组成（大约130-150bp），由癌细胞通过凋亡、坏死或分泌释放到循环系统中。ctDNA的半衰期较短致使其成为敏感的实时肿瘤负荷标志物，它的存在可能反映了影像学上看不见的微转移。

在治愈性治疗结束后，ctDNA中出现的体细胞突变对随后的影像学复发具有较高的阳性预测价值，特别是当这些突变与切除的肿瘤组织中的突变相匹配时。检测这种ctDNA定义的MRD可以在I-III期CRC中提前影像学数月预测复发，从而为一组最终会复发的CRC患者提供一个评估新疗法的窗口。然而，这些ctDNA体系突变定义的MRD检测方法的灵敏度仍然是有限的，迫切需要改进其检测性能。

ctDNA的甲基化检测优于ctDNA的体系突变检测。ctDNA的甲基化异常在CRC中非常常见，并被视为大多数肿瘤癌变的早期阶段。这种甲基化，具体定义为DNA中胞嘧啶的C5位置添加甲基基团，调节附近基因的表达，包括经典的肿瘤抑癌基因失活。与体系突变相比，CRC中存在更多的甲基化异常区域，为提高MRD检测的灵敏度提供了机会。SEPT9，就是第一个利用血液检测单基因甲基化异常进行筛查和早期检测CRC的方法。尽管ctDNA甲基化有这些优点，但这些相同的特性也需要谨慎，以保持检测分析的特异性，并尽量减少假阳性的可能性。

在这种背景下，Parikh和Taieb的这两项最新研究结果为我们对ctDNA性能的理解提供了有用的补充，即无需原发肿瘤组织，仅通过血液ctDNA甲基化或联合ctDNA突变即可进行准确的MRD评估。与其他需要对原发肿瘤组织进行测序以指导后续ctDNA分析的检测不同，这两项研究探讨了Tumor-uninformed assays的有效性，它有几个优势，包括快速的TAT，降低初始成本，对肿瘤组织不足或不可用的患者进行监测。

Parikh等人提供了一种ctDNA甲基化结合ctDNA体系突变的固定panel进行MRD的分析评估（NGS方法），与其他商业上可用的MRD检测方法相比，这种方法不需要切除的肿瘤组织以及定制化。在最终治疗后使用时，这种仅血浆ctDNA-MRD检测对复发具有临床意义的特异性（100%）和灵敏度（55.6%），通过整合表观基因组特征和纵向监测分析，其灵敏度可进一步提高至91%。¹ 该方法被用于正在进行的前瞻性研究，包括指导IIA期结肠癌治疗决策的NRG合作组研究（NCT04068103）。虽然还需要额外的数据集来验证这些发现，但这些结果证明了基于ctDNA的MRD检测在肿瘤不知情的情况下可接受的检测性能特征。

Taieb等人的研究利用了一对先前被证明是CRC切除后预后相关的甲基化基因标记物WIF1和NPY（ddPCR方法），并将它们应用于PRODIGE-GERCOR IDEA-France试验，将III期CRC患者随机分为3个月 vs 6个月的辅助化疗。在对参加III期试验的III期CRC患者进行的首次ctDNA-MRD评估中，有13.8%的患者术后为ctDNA-MRD阳性，并被确认为独立的预后标志物。³ 同时，研究者也指出，与其他采用NGS方法的ctDNA-MRD研究相比，本研究中ctDNA的阳性率较低。灵敏度和PPV同样低于NGS检测结果，ctDNA-MRD阳性和阴性的5年DFS分别为65%和73%，尽管辅助治疗的疗效和不理想的前分析样本处理可能会对这些结果产生负面影响。该方法值得注意的是其相对简单，非常低的成本和潜在的重现性，不需要商业检测中所见的专利检测方法。正在进行的前瞻性研究将进一步评估仅血浆ctDNA检测是否能够准确评估MRD，以便对CRC患者进行风险分层，并指导辅助治疗决策。

无论采用何种方法，仅用血浆ctDNA-MRD检测来指导CRC患者的治疗决定，需要可靠且准确的检测方法。需进一步提高仅血浆ctDNA-MRD检测的灵敏度来确定哪些患者可以从治疗降级中获益，以避免不恰当地选择高危患者接受较低强度的治疗。Parikh及其同事的研究结果表明，整合基因组和表观基因组以及纵向血浆监测，可显著提高仅血浆ctDNA-MRD的灵敏度。相比之下，ctDNA-MRD检测的高特异性对于ctDNA作为一个完整的生物标志物来确定治疗升级是至关重要的。由于特异性不足，假阳性的ctDNA-MRD可能会使患者接受不必要的强化治疗。Parikh及其同事的研究结果证明，除体系突变外，还可以通过结合表观基因组甲基化特征的分析来保持特异性。Taieb等人的分析方法的优势在于提高了临床特征的灵敏度和预后，但是，正如研究者承认的那样，单独的两个基因甲基化标记可能无法提供与结合体系突变方法的性能特征。重要的是，这项工作也强调了标准化分析前条件的重要性，因为各种提取方法可以在很大程度上影响ctDNA的得率和完整性。在未来的研究中，这些分析前的考虑将变得越来越重要。

甲基化被纳入MRD检测的潜力是明确的，希望这些进展将继续提高下一代MRD检测的性能。总之，仅血浆ctDNA-MRD的检测提供了一个独特的机会，使用一种无创方法来探索治疗方案，并有可能根除高危患者的微转移性病灶。这些研究结果无疑为未来ctDNA-MRD指导的前瞻性临床试验铺平了道路。

MRD，仍然是一个快速发展的领域，我们预计近两年可能会出现新的证据，要么显示出MRD检测的临床效用的局限性，要么显示出MRD检测的其他优势和新用途。