CRISPR的每一次登场，总是自带话题性，从基因编辑，到专利之争，再到下一代分子诊断技术，特别是在分子诊断行业，总流传着它的传说。 一、CRISPR/Cas系统简介 CRISPR的全称是Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（成簇规律间隔的短回文重复序列），形如其名，CRISPR 序列结构正是成簇的规律间隔的短回文重复序列，该序列与CRISPR associated（Cas）蛋白组成CRISPR/Cas系统。CRISPR/Cas系统是原核生物的一种自我保护机制，是细菌用来抵抗外来遗传物质入侵的适应性免疫防御系统。其发挥免疫的功能包括适应、表达和干扰3个阶段。在适应阶段，细菌通过Cas蛋白（Cas1和Cas2）捕捉入侵的外来核酸，并整合至自身基因组的CRISPR 序列中形成记忆功能，以便下次出现入侵时，细菌可启动免疫反应；在表达阶段，CRISPR 序列转录生成前体crRNA (pre-crRNA)和反式激活RNA(trans-activating crRNA, tracrRNA)，pre-crRNA通过加工，形成含有与外来基因序列匹配的crRNA，crRNA与tracrRNA通过碱基配对形成向导RNA（single-guide RNA，sgRNA），用于Cas蛋白的募集；在干扰阶段，sgRNA引导Cas蛋白定位到与其同源的外来核酸靶标，并激活Cas蛋白的内切酶活性，对靶标核酸进行切割，从而发挥免疫功能。
二、CRISPR/Cas分子诊断技术的建立 提起CRISPR，我们就不能不说起麻省理工的张锋和加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna。两者不但在CRISPR基因编辑上做出奠基性贡献，也对CRISPR在分子诊断行业的应用做了开拓性工作。正是两位大牛在2015~2018年这四年的你来我往中，开启了CRISPR分子诊断这一全新领域。下面，我们来看看高手之间的过招，是如何让吃瓜群众拍案叫绝的。 （1）2015年9月，张锋团队在Cell发表论文，报道了CRISPR/Cas系统中另一种RNA向导的核酸内切酶(Cpf1)，后改名为Cas12a，日后其将在CRISPR/Cas分子诊断系统发挥重要作用。 （2）2015年10月，张锋团队在Molecular Cell发表论文，通过在基因库里“钓鱼”，又发现了三个新的CRISPR/Cas系统效应蛋白，分别为C2c1, C2c2, 和C2c3，其中C2c2蛋白后来被重新命名为Cas13a，并成为开启CRISPR分子诊断大门的第一把钥匙。 （3）2016年6月，张锋团队在Science发表论文，进一步阐述了C2c2(Cas13a)的功能和机理，与Cas9不同，C2c2(Cas13a)仅需在crRNA 的引导下，即可作用于入侵病原体的单链RNA；更为重要的是，C2c2-crRNA一旦与匹配的RNA结合，进入激活状态后，除了特异性剪切靶RNA外，还启动了非特异性内切酶活性，即对任何单链RNA进行剪切；这就开始显现出了CRISPR/Cas系统作为分子诊断工具的特性，但该论文当时并未将C2c2(Cas13a)的特性和诊断技术联系起来。 （4）2016年9月，Doudna团队在Nature发表论文，研究了来源于不同菌类的C2c2(Cas13a)，发现C2c2(Cas13a)还有将pre-crRNA加工成crRNA的功能，同时验证了张锋团队关于C2c2(Cas13a)具有特异性剪切靶RNA和非特异性降解其它RNA功能的结论，并由此提出和测试了C2c2(Cas13a)用于分子诊断的可行性。 （5）2017年1月，张锋团队在MolecularCell发表论文，再次通过“钓鱼”方法发现了其他Cas蛋白成员：Cas13b及其辅助蛋白Csx27和Csx28，其中Cas13b为以后实现多重检测带来了可能性。 （6）2017年4月，张锋团队在Science发表论文，第一次系统介绍了CRISPR/Cas作为分子诊断技术的应用，该方法将恒温扩增技术RPA和Cas13a系统结合起来，实现了对病原体高特异性、高灵敏度的检测，命名为Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing，简称SHERLOCK。 （7）2017年5月，Doudna团队在Molecular Cell发表论文，发现所有Cas13a可被分为两个亚族，不同亚族Cas13a识别不同的crRNA序列，激活后的Cas13a-crRNA对同一报告RNA的非特异剪切活性也存在差别，这为CRISPR/Cas系统实现多重检测建立了理论基础。 （8）2018年2月，Doudna团队和张锋团队分别在Science发表了一篇论文。Doudna团队主要发现Cas12a被激活后可非特异性地剪切、降解单链DNA，并以此建立了另一个CRISPR/Cas分子诊断技术，命名为DNA Endonuclease-targeted CRISPR Trans Reporter，简称DETECTR，为了提高灵敏度，该方法同样引进了RPA对靶标进行扩增放大产物。张锋团队的同期论文则主要对SHERLOCK进行改进升级，实现了该方法的多重化、定量化和可视化，命名为SHERLOCK v2，为了实现多重检测，他们通过筛选确定了不同来源的Cas12a、Cas13a和两个Cas13b，并基于四个Cas蛋白对应的crRNA不同，以及激活后剪切的核苷酸对差异，由此构建出了一个可实现四重检测的分析方法；为了实现定量检测，他们通过对RPA扩增阶段的引物浓度进行系列稀释测试，筛选出合适的引物浓度，使得RPA扩增过程处于线性增长阶段，从而实现SHERLOCK在较宽样品浓度范围内的定量；最后的可视化，主要是为了实现CRISPR/Cas诊断系统在POCT的应用，他们将CRISPR/Cas检测技术与侧向层析相结合，通过肉眼可见的显**况来判读结果。 （9）2018年4月，张锋团队继续在Science发表论文，对SHERLOCK的前处理方法进行改良，发明了Heating Unextracted Diagnostic Samples to Obliterate Nucleases，简称HUDSON，该方法不经核酸提取纯化，仅需对临床样本进行核酸酶灭活和加热等快速处理，即可用于后续SHERLOCK反应，利用HUDSON+SHERLOCK技术，在2小时内便可肉眼观测到寨卡病毒和登革热病毒的检测及分型结果。 （10）2018年10月，Doudna团队在Science发表论文，报道了另一个新的Cas蛋白——Cas14，该蛋白分子量更小，识别的靶标为单链DNA，激活后除了剪切靶ssDNA外，还非特异性地剪切其它ssDNA，而且该蛋白不受PAM序列的限制，对靶ssDNA的特异性识别能力更强，由此开发出的Cas14-DETECTR可用于SNP检测。 （11）至此，CRISPR/Cas分子诊断技术中最常用的三个Cas蛋白已悉数亮相。实际上，对于CRISPR/Cas分子诊断技术的推进发展，并非只有张锋和Jennifer Doudna两个团队在忙活，国内也有其他研究者致力于优化和改进CRISPR/Cas分子检测系统。例如： ①2018年4月，中国科学院上海生命科学研究院王金团队在Cell Discovery发表了基于Cas12a的分子诊断技术，该技术名称为one-HOur Low-cost Multipurpose highly Efficient System，简称HOLMES，该方法利用PCR对靶标进行扩增后，再利用CRISPR/Cas12a系统进行检测，后将Cas蛋白换为嗜热的Cas12b，并与恒温扩增技术LAMP（LAMP扩增原理详见聊聊恒温扩增技术-LAMP & CPA）结合，升级为HOLMES v2； ②2018年9月，中国科学院深圳先进技术研究院喻学锋团队在Nature Communications发表了基于Cas9切口酶活性开发的分子诊断技术，该技术名称为CRISPR-Cas9-triggered nicking endonuclease mediated Strand Displacement Amplification method，简称CRISDA，该方法使用等温扩增扩增技术SDA作为扩增手段，利用HNH结构域失活的Cas9切割打开靶DNA 的一条链，再用引物启动SDA 反应，最后使用肽核酸探针进行检测，该方法在复杂的背景干扰下仍具有高特异性和灵敏度。
三、CRISPR/Cas分子诊断技术的原理 1.基于CRISPR/Cas9系统特异性识别和切割DNA序列的功能 Cas9的主要应用是在基因编辑，其形成的复合物在sgRNA的引导下，通过识别靶标DNA上的PAM(protospacer-adjacent motif)，特异性地与靶标DNA结合，并切割靶标DNA。基于CRISPR/Cas9系统特异性识别和切割DNA序列的功能，其分子检测方法可分为2类。 (1)基于切割功能的检测方法 ①NASBACC技术：NASBA-CRISPR Cleavage(NASBACC)技术将恒温扩增技术NASBA、toehold开关RNA传感器和CRISPR/Cas9系统进行结合，实现了寨卡病毒的分型检测，其反应原理如图1所示：首先靶标RNA通过NASBA（NASBA扩增原理详见转录介导的核酸扩增技术小结）技术在引物的设计上，引入T7转录启动子和带有toehold开关触发的序列，扩增过程中产生的双链DNA若含有特异性PAM序列和gRNA识别位点时，将被Cas9切割成两段，含有T7转录启动子的序列经T7 RNA聚合酶转录出截短的RNA，该短RNA由于缺乏传感器H触发序列，因此无法激活传感器H的toehold开关；若双链DNA不含PAM序列，则可被T7 RNA聚合酶转录出含有传感器H触发序列的全长RNA产物，从而激活传感器H；传感器H在被激活前，通过隔离核糖体结合位点（RBS）和起始密码子顺式阻断LacZ基因的翻译；当toehold开关与互补的触发RNA结合后，RBS和起始密码子被释放，激活LacZ基因翻译表达β-半乳糖苷酶，该酶可将黄色底物（氯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷）转化为紫色产物（氯酚红），从而实现肉眼可见的颜色变化。
②CAS-EXPAR技术：CRISPR/Cas9 triggered isothermal exponential amplification reaction(CAS-EXPAR)是基于CRISPR/Cas9的切割反应和切口内切酶（NEase）介导的核酸扩增反应，其反应原理如图2所示：首先，Cas9与sgRNA结合形成复合物，并在PAMmer的协助下识别靶标序列，在靶标序列的特异位点切割生成目标片段X；该目标片段X可作为引物，与扩增模板结合（该扩增模板含有两个与目标片段X互补的区域X’，被NEase识别序列间隔开），并在DNA聚合酶作用下，合成含有NEase识别位点的完整双链DNA；NEase通过识别酶切位点在双链DNA上引入切口，DNA聚合酶在切口处再次延伸形成双链DNA，并置换出目标片段；置换出的目标片段可作为引物，与另一个扩增模板结合启动DNA合成，从而形成循环扩增过程，生成大量双链DNA产物，可用SybrGreen I等荧光染料进行检测。
（2）基于定位功能的检测方法 Cas9蛋白含有 HNH和 RuvC两个核酸酶结构域，用于切断dsDNA，将这两个结构域的核酸酶活性区域突变，使 Cas9失去剪切dsDNA 能力，则形成Cas9突变体dCas9。dCas9 保留了特异性靶向dsDNA的功能，通过在dCas9上融合其他功能蛋白，可构建CRISPR/dCas9检测系统。 ①PC技术：paired dCas9(PC)使用一对dCas9蛋白，分别融合荧光素酶的两个分离结构域（NFluc和CFluc），并通过两个靶向相邻序列的gRNA实现检测。其反应原理如图3所示：当存在靶标DNA时，两个分别带有荧光素酶结构域的dCas9，在gRNA的引导下结合到相邻的靶标序列上，荧光素酶的两个分离结构域相互靠近，形成有活性的荧光素酶，在ATP和氧气存在条件下，催化荧光素氧化，生成氧化荧光素，并产生可检测的荧光信号。
②RCH技术：RCA-CRISPR-split-HRP(RCH)结合了滚环扩增(Rolling Circle Amplification,RCA)、CRISPR/dCas9和辣根过氧化物酶(HRP)技术，可经显色反应区分miRNA的单碱基差异。其反应原理如图4所示：首先，靶标miRNA与哑铃状特异性探针结合，打开探针的双链茎部区域，形成环状探针，并在phi29 DNA聚合酶作用下进行滚环扩增，形成很多重复连续的单链DNA序列，且由于序列本身存在互补配对区域，可经互补配对形成大量规则的茎-环结构；然后，加入融合了split-HRP报告片段的dCas蛋白，并在sgRNA 的引导下，定位至扩增产物的茎-环结构，分离的HRP报告片段因此聚集，形成有活性的HRP蛋白；HRP蛋白发挥催化活性，使得黄色底物TMB转化为蓝色产物。
2.基于CRISPR/Cas系统反式切割活性的检测技术 该检测技术所用的Cas蛋白主要有Cas12、Cas13和Cas14，这类蛋白除了与Cas9一样，具有特异性切割靶序列的功能外，在激活状态下，还具有非特异性切割其它核酸序列的功能。在没有激活的状态下，Cas蛋白保持沉默，不会胡作非为；一旦被激活，便是一个没有感情的收割机，高举镰刀，看到韭菜就要割，被割下的一茬茬绿油油韭菜，即是可用来检测的信号。基于Cas蛋白的这个特点，张锋和Doudna各自创立了对应的体外诊断公司，专注于开发与CRISPR/Cas系统相关的体外诊断技术及产品。 （1）基于Cas12开发的诊断技术 Cas12仅需在crRNA引导下即可识别靶标dsDNA，并靶向富含T的PAM位点，对靶序列进行特异性切割，同时附带非特异性切割ssDNA的活性。基于Cas12开发的分子诊断技术主要有DETECTR(图5A)和HOLMES(图5B)，其中HOLMES将Cas12a更换为Cas12b后，进一步升级为HOLMES v2(图5C)。该三种方法原理类似，主要区别是对靶标扩增方法的选择不一样。首先，靶标核酸经等温（RPA或LAMP）或变温（PCR）方法扩增富集；然后，扩增产物与Cas12-crRNA结合，激活Cas12的附属切割功能，对ssDNA荧光探针进行切割，释放荧光基团，形成检测信号。
（2）基于Cas13开发的诊断技术 Cas13是一种RNA引导的RNA核酸内切酶，可在crRNA的引导下特异性切割单链靶标RNA，并在完成切割后，可继续保持活性并切割其他非靶标RNA。基于Cas13开发的分子诊断技术主要为SHERLOCK，其反应原理如图6A所示：靶标核酸经等温扩增技术RPA扩增并引入T7启动子序列后，再利用T7 RNA聚合酶转录形成ssRNA，转录产物与Cas13a-crRNA结合，激活Cas13a核酸酶活性，切割ssRNA荧光探针，释放可被检测的荧光基团。SHERLOCK通过进一步优化，升级成了SHERLOCK v2（图6B~E），可进行高灵敏度的多重、定量检测，结合侧向层析技术还可实现可视化检测。
（3）基于Cas14开发的诊断技术 Cas14是一种RNA 引导的靶向ssDNA核酸酶，该酶分子量更小，对ssDNA的特异性识别能力更强，且不受PAM序列的限制，激活后可附带非特异性切割ssDNA的活性。基于该酶特点，Doudna团队将DETECTR技术使用的Cas12a更换为Cas14a，开发出了Cas14-DETECTR诊断技术，其反应原理如图7所示：首先，用于扩增富集靶标核酸的其中1条引物需进行硫代磷酸化（phosphorothioate, PT）修饰，由此扩增产生的dsDNA经T7核酸外切酶作用，降解其中一条未被PT保护的DNA链，从而形成ssDNA，并作为靶标ssDNA激活Cas14a内切酶活性，非特异性切割ssDNA荧光探针，生成信号。
四、CRISPR/Cas分子诊断技术的优势与不足 CRISPR/Cas系统作为分子诊断技术，主要是基于该系统特异性识别和切割核酸序列的功能建立的，其中切割功能中的反式切割属性，是CRISPR/Cas系统发挥体外诊断能力的最主要功能。具有反式切割活性的三种Cas蛋白（Cas12、Cas13和Cas14）被激活后，可对非靶标核酸进行切割，将检测信号进一步放大，提高了检测灵敏度，同时gRNA对靶序列的特异性识别，进一步提高了检测特异性，使得CRISPR/Cas诊断系统具有高灵敏度、高特异性的特点。不同特性Cas蛋白的发现（表1），丰富了检测核酸类型的选择，从dsDNA到ssDNA再到RNA，均可作为CRISPR/Cas分子诊断系统的靶序列，结合层析技术等显色反应，还可实现检测结果的可视化，为分子POCT领域的应用场景带来了无限可能。 CRISPR/Cas系统作为一种可特异性识别靶序列，并具有催化放大信号功能的检测技术，可直接对靶标序列进行检测，但目前的检测方法，均需预先扩增靶标核酸后，其检测灵敏度方可满足诊断要求，这就增加了操作步骤，耗时也更长了。CRISPR/Cas系统的反式切割活性具有随意性，对实现定量和多重检测的难度较大。现有Cas蛋白大部分依赖于PAM序列发挥作用，对靶标序列的选择受到限制。作为一种基因编辑技术，其脱靶效应的存在也会影响到诊断结果的准确性。但是，CRISPR/Cas系统作为下一代诊断技术的引领者，相信国内外会有研究者正在潜心改进这个技术，使得CRISPR/Cas系统更趋近于理想的诊断技术。
五、关于CRISPR/Cas分子诊断技术的一点思考 CRISPR/Cas诊断系统自发明以来，一直被大家所关注，但是目前该技术更多处于实验室测试阶段，临床上的应用价值还没展现出来。在新型冠状病毒的检测上，从张锋公布了CRISPR/Cas检测新冠的流程，到国内第一个使用CRISPR方法检测新冠产品获批，本以为该技术会从此腾飞，但还是在喧闹中慢慢沉寂了。毕竟，相比其它分子诊断技术，CRISPR/Cas分子检测系统，从发明到现在仅有几年时间，作为一种新的方法，为市场所接受还需时日。另外，作为一种专利主要集中在少数几个企业的新技术，其它企业如果推广该技术的应用，是否存在侵权风险，这也可能是大家所忧虑的。 |
/3 
浙公网安备33010802005999号 
