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羧基磁珠提纯核酸的一种技巧!

2021-12-7 17:47| 编辑: 归去来兮| 查看: 2989| 评论: 0|来源: 纳微科技

摘要: 1磁珠法核酸提取基本原理首先,磁珠是一类特殊的纳微米材料,它们的尺寸通常在零点几微米到几微米之间,仅为一根头发丝直径的十几分之一到几十分之一,肉眼是无法观测到单个磁珠的。其次,它们具有超顺磁性,在磁场 ...


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磁珠法核酸提取基本原理 


首先,磁珠是一类特殊的纳微米材料,它们的尺寸通常在零点几微米到几微米之间,仅为一根头发丝直径的十几分之一到几十分之一,肉眼是无法观测到单个磁珠的。

其次,它们具有超顺磁性,在磁场中可以向一侧迅速移动,聚集在一起,而去除磁场后又能够迅速恢复到分散状态。

最后,用于核酸提取的磁珠表面具有特定的性质,在某些条件下能够将病毒核酸吸附在表面,在另一些条件下又能将病毒核酸从表面释放下来,用于后续的检测步骤。

(图1:左:MS磁珠的TEM;中:MS磁珠的SEM;右:MS磁珠在管子里无磁铁时分散和有磁铁时向一侧聚集的图片;说明:纳微核酸提取磁珠的电镜图片及其在磁场中的移动)


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如何评估磁珠法提取核酸的效果? 


可以按照PQR三原则法进行评价:

P指的是Purity(纯度)具体而言就是磁珠提取后的核酸中含有多少非核酸类的杂质残留,如蛋白、盐、多糖等。该指标通常用吸光度比值(A260/A280和A260/A230)来衡量。

Q指的是Quality(质量),磁珠提取后的核酸尤其是较长的基因组核酸应保持其完整性,不应出现断裂或降解等现象。该指标可通过简单的凝胶电泳或者复杂一些的特定PCR及微流控芯片(如Agilent Bioanalyzer)进行评估。

R指的是Recovery(收率),磁珠提取过程应当尽量将所有的核酸都能从样本中提取出来。高收率对于核酸检测尤其是疾病早期检测的灵敏度至关重要,在疾病早期,样本中的病原体核酸含量通常较低,如果不能高效率地提取到所有核酸,那么很容易出现假阴性,导至漏检。


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磁珠如何与核酸结合,实现提取功能? 



这就涉及到比较深入的生物化学知识。

核酸作为一种生物大分子,之所以能够在水溶液中稳定分散不沉淀,是由于三种非共价作用力的存在:

(1)静电相互作用

(2)范德华力

(3)氢键

核酸分子具有多个磷酸基团,呈现高度负电性,分子间互相排斥从而避免发生团聚。

此外,核酸分子在水溶液中通过氢键与范德华力结合了大量的水分子在其周围,形成一个水化层,也阻止了分子间的聚集。

因此,要使得核酸分子结合到磁珠表面,就必须削弱上述作用力,屏蔽溶液中的静电斥力,同时破坏核酸分子表面的水化层,使其能够与磁珠表面相接触,进而产生吸附。

综上所述,磁珠表面的性质对于核酸提取至关重要。
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羧基磁珠

这类磁珠除了能够像硅羟基磁珠一样在高浓度离液盐环境中结合核酸分子之外,还能通过另一种特殊的机制与核酸分子结合。
通过向溶液中加入一定浓度的PEG和NaCl,可以使得核酸分子从伸展的构象逐渐蜷缩成小球状,其上的负电荷也大部分被屏蔽掉,促使核酸分子吸附到磁珠上。
核酸分子的分子量越大,越倾向于发生这种从伸展线团向蜷缩小球的构象变化因此,通过调节盐溶液与核酸样本的体积比,能够实现较大分子量的核酸片段在羧基磁珠表面的优先吸附,达到所谓的片段筛选效应

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