技术原理拆析：Seegene实现单管多重核酸检测的三大核心技术

2021-11-5 14:46| 编辑: 归去来兮| 查看: 6178| 评论: 0|来源: IVD技术咖

摘要: 在PCR过程中，DPO™引物分为两步退火步骤。较长片段的5’端序列Tm值较高，优先与靶标序列结合，稳定DPO™引物与靶标退火步骤；继而较短片段的3’端结合至靶标序列上，启动特异性延伸；而连接5’和3’ ...

在多重核酸检测领域，凭借自身核心技术不断进阶升级的厂家，除了Luminex外，还有一家韩国公司——Seegene。Seegene公司专注于分子诊断，研发的多重PCR技术，可实现单管多靶标检测，目前产品涉及传染病、遗传学和肿瘤学。该公司拥有独有的三大核心技术：DPO™、TOCE™和MuDT™，是实现单管多重核酸检测的三大利器。

一、DPO™技术

1.原理介绍

Dual Priming Oligonucleotide(DPO™)是一种新型的多重靶标扩增引物设计方法，可提高靶标检测特异性，减少非特异性扩增。该技术可用于“一管多重”检测，也适用于多重实时PCR检测。

DPO™引物结构不同于常规引物，由三部分组成。5’端部分相对较长，是引物退火过程中的稳定序列；3’端部分相对较短，是引物延伸的决定序列；中间插入的多聚脱氧肌苷(Poly-dI linker)，将两端的特异性功能序列连接起来。

在PCR过程中，DPO™引物分为两步退火步骤。较长片段的5’端序列Tm值较高，优先与靶标序列结合，稳定DPO™引物与靶标退火步骤；继而较短片段的3’端结合至靶标序列上，启动特异性延伸；而连接5’和3’端的Poly-dI linker在引物退火过程中，会形成泡状结构，可调节DPO™引物的两步退火过程，确保引物启动特异性扩增。

2.特点分析

（1）DPO™引物的特殊设计，可阻断核酸多重反应中非靶标序列的错误延伸。在PCR过程中，即使DPO™引物的5’端长片段部分,结合至非靶标序列上，也会因为3’端无法互补配对而无法延伸扩增；DPO™引物的3’端由于片段较短，在退火温度中，无法单独结合至非靶标序列上启动扩增。

（2）DPO™引物的结构特点，使其在较宽的退火温度范围内，依然能保持良好的扩增特异性，其允许靶标序列在退火温度差别近10℃的情况下扩增。

（3）DPO™引物的独特结构，可避免形成引物二聚体和复杂的二级结构、防止多重靶标引物间的竞争，因此可实现单个反应中，多靶标扩增时的等效性和同步性。

（4）综合以上特点，DPO™技术特别适用于单管多重核酸检测。

二、TOCE™技术

1.原理介绍

Tagging Oligonucleotide Cleavage & Extension(TOCE™)是一种新型的多重实时PCR检测技术，可同时检测5个及以上的靶标基因和基因型。该技术通过设计独特的寡核苷酸，以及特殊的信号生成和熔解温度分析，克服了基于靶标序列的探针法实时PCR技术限制，充分发挥了多重实时PCR技术的检测潜力。采用TOCE™技术可检测和区分单个反应管中的多个靶标，还可通过cyclic-CMTA分析获取定量结果。

TOCE™技术的关键组分：DPO™引物对、Pitchers和Catchers，这三种独特的寡核苷酸，是该技术区别于常规实时荧光多重PCR的要点。其中，DPO™引物对用于靶标区域的特异性扩增；Pitchers是5’端带有标签序列的寡核苷酸，其3’端的特异序列部分可与靶标区域结合，但因3’端封闭而无法延伸；Catcher是双标记的人工合成模板，其3’端含有捕获序列，可与Pitchers 的5’端标签序列互补配对。

在PCR过程中，DPO™引物和Pitcher的特异序列结合至靶标序列上；DNA聚合酶在DPO™引物退火引发的延伸过程中，其5’外切酶活性将特异性切割结合在靶标序列的Pitcher，释放其标签序列；释放后的标签序列与Catcher的捕获序列杂交，并以Catcher作为模板引发延伸；在无靶标扩增情况下，Catcher在溶液中处于无规则卷曲状态，其标记的荧光基团和淬灭基团相对靠近，荧光信号较弱；而当Pitcher标签序列结合至Catcher上，引发延伸合成双链时，则会形成伸展状态，荧光基团和淬灭基团因此远离，产生荧光信号；其产生的信号可实时检测，也可采用熔解曲线分析。其中，熔解曲线分析是该技术实现核酸多重检测的关键。从TOCE™技术的反应原理中可以看出，生成的双链Catcher产物中携带荧光基团和淬灭基团，随着温度的升高，其双链结构发生解链，Catcher再次形成无规则卷曲状态，致使荧光信号减弱，对此进行熔解曲线分析，便可区分多个靶标。而且，Catcher是人工合成的模板，可通过调整其碱基组成和数量，控制Tm值，使得不同靶标易于区分，从而实现单通道多靶标的检测。

2.特点分析

（1）TOCE™技术以人工设计的Catcher作为模板进行检测，在熔解曲线分析中具有诸多优势。其一，人工设计的模板Tm值不受靶标序列变异的影响，熔解曲线分析更加稳定可靠；其二，人工设计的模板Tm值更加可控，调整Catcher序列和长度即可设计不同Tm值的Catcher。通过分析每个荧光通道的Tm值，便可区分多重PCR检测靶标。目前Seegene可分析单个荧光通道中的5个靶标，因此对于四色荧光通道，在单管中便可检测20个靶标。

（2）TOCE™技术可衍生成mTOCE™技术，用于点突变检测。将碱基突变点设计在Pitcher标签序列与靶标特异序列的连接处，当靶标序列含有突变碱基时，切割下来的Pitcher标签序列3’端，与Catcher序列完全互补配对，可启动延伸产生检测信号；而靶标序列不含突变碱基时，切割下来的Pitcher标签序列3’端，无法与Catcher序列互补配对，因此无法延伸，导至无检测信号产生。该方法同样可在单管中区分多个点突变。

（3）TOCE™技术结合cyclic-CMTA(Cyclic Catcher Melting Temperature Analysis)可实现定量检测。通过在扩增过程中的特定阶段，采集熔解温度进行分析，对照不同浓度标准品开始出现熔解峰的阶段，可对样本浓度进行定量。例如，对高浓度样本，在第一阶段(30 cycle)便开始检测到熔解峰；对于中浓度样本，在第二阶段(40 cycle)才检测到熔解峰；对于低浓度样本，则需在第三阶段(50 cycle)才能检测到熔解峰；而对于阴性样本，则从始至终均未检测到熔解峰。该方法可用于多重定量检测，即通过Tm值区分不同靶标，再通过熔解峰出现的阶段确定靶标浓度。

三、MuDT™ 技术

1.原理介绍

Multiple Detection Temperatures (MuDT™)是一种新型的实时PCR分析技术，可用于检测单一荧光通道中，多个靶标各自的Ct值。常规实时荧光PCR，在每个循环扩增中只采集一次荧光，而MuDT™需在每个循环扩增的两个不同温度，采集两次荧光，再利用这两个检测温度的荧光信号变化，结合软件分析，计算出同一荧光通道中两个病原体（如共感染样本）各自的Ct值。该方法无需通过熔解曲线区分不同病原体，通过两步实时荧光采集和软件分析，即可区分同一荧光通道下的两个病原体，因此可使常规实时荧光PCR仪的检测靶标数翻倍。

2.特点分析

（1）MuDT™技术通过改变荧光采集方式，并结合软件分析，提高了单一荧光通道的检测靶标数，无需对常规实时荧光PCR仪器进行硬件升级，最大限度利用现有实时PCR仪。目前Seegene可对同一荧光通道的三个靶标进行区分，这样便可将实时PCR仪的检测靶标数提升至三倍。

（2）通过比较不同检测温度下的荧光强度变化，区分病原体并计算出对应的Ct值，实现了单通道多Ct值的检测方法。基于该技术，可进行多重实时定量检测，也可用于SNP基因分型检测，同一荧光通道即可区分野生型、突变体或杂合体。

（3）Seegene开发的分析软件（Seegene Viewer）可兼容任何PCR仪，可自动分析多重实时PCR数据，对多重靶标的Ct值进行识别和区分。

四、总结

Seegene开发的三大核心技术：DPO™、TOCE™和MuDT™，串联了分子诊断中的扩增、检测和分析三大关键步骤，也基于此开发了一系列单管多重核酸检测产品，实现了“All in One Tube”的检测方法。作为一家具有强大分子诊断方法的企业，更需要强大的仪器来发挥其优势。目前，Seegene产品的样本处理和核酸扩增过程均需借助外部设备来完成，喊出的口号只能是“All in One Platform”。其平台使用的核酸全自动提取仪来自汉密尔顿(Hamilton)、PCR扩增仪来自伯乐(Bio-Rad)。但在大家张口闭口便是“Sample in, Result Out”的内卷氛围里，相信Seegene在不久的将来也会喊出“All in One Instrument”的口号。

参考资料

[1] Seegene官网.

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