分子技术丨dPCR检测技术介绍

今天，我们聊一聊dPCR技术，首先，我们先了解下什么是dPCR？

dPCR：数字PCR（Digital PCR，dPCR），通过将待测样本进行极限稀释，使每个反应室中平均只有一个拷贝或者没有目标DNA分子，然后加入荧光信号进行PCR扩增，可以检测到低至一个拷贝的突变。

dPCR检测原理：数字PCR是一种核酸检测和绝对定量的新方法。同传统PCR以及qPCR相比，数字PCR增加了一步分液(partitioning)的操作，将几十微升的已经配好的包含有引物、模板、buffer、酶等组分的PCR反应体系分隔成了众多微小的、独立的反应体系，这样能够直接数出DNA分子的个数，对起始样品绝对定量，通过将一个样本分成几万到几百万份，分配到不同的反应单元，每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子( DNA 模板) ，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析，有荧光信号记为1，无荧光信号记为0（不同于qPCR 对每个循环进行实时荧光测定的方法，数字 PCR 技术是在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集）。在分配的过程中，引物、酶等组分过量，而模板则是不过量的。模板DNA分子随机地进入到各个小的反应体系中，经过PCR扩增后，包含模板的体系完成扩增，不包含模板的体系无扩增（ddPCR的原理与荧光PCR的反应原理和是一样的，可以设计TaqMan探针、分子信标探针或者采用染料法进行检测，伯乐公司推荐使用BHQ1作为粹灭基因）。模板DNA分子进入各个小的反应体系的过程满足泊松分布规律，因此，检测扩增PCR产物的信号强度，带入泊松分布公式计算，即可计算出起始模板DNA分子的拷贝数。（目前数字PCR有两种分配技术原理，见下图1和2）

图1 芯片式数字PCR原理

图2 油包水液滴式数字PCR原理

超强的泊松统计：由于dPCR是一种终端分析法，如果目标分子没有很好的离散化，如一些小室在结束时具有不止一个的靶标（比如说在一个液滴中同时出现了几种突变的靶标，列如KRAS、EGFR、BRAF和TP53等），那么理论上结果得到的浓度可能就会弃之不用。这就是泊松统计发挥作用的地方。据Bio-Rad实验室数字生物学中心科学事务部主任GeorgeKarlin-Neumann称，泊松统计描述了一种随机分布。只要小室没有达到饱和，用户就可以反算他们起始的分子数，即使一些孔中实际上容纳了不止一个分子（这种情况在数字PCR中读做单一计数）。只要你告诉我你有多少小室或者多少液滴，（并且）它们中多大比例呈阴性。它就会基本上告诉我初始的浓度，这也将告诉我阳性小室与阴性小室的比例。

分子混合物被离散或分隔化到大量的反应室中（越多越好），这样每个室中平均有一个或零个目标核苷酸。对每个区划进行PCR反应后，使用泊松统计将阳性信号的计数转换为一个绝对值。如果将这一过程比作一代测序（Sanger测序），在单个管中对100个模板分子的混合物（其中有一个是突变的）进行测序会产生一个电泳图谱，其中在突变位点上的显著信号会是野生型碱基。你甚至基本不会发现，在（信号峰）下存在着一个表示不同碱基读取的小突起，因为它在整个分子混合物中的占比太低了。但将这些分子稀释并将其分布在多重反应中，就能产生出99个野生型信号和一个明显的突变信号，这就是数字的、绝对定量的结果，也是dPCR最大的优势之处。

dPCR与qPCR比较

数字PCR与传统PCR技术不同，数字PCR采用绝对定量的方式，采用的策略简单概括就是“分而治之”，类似于计算机科学中的“分治算法”，将一个标准PCR反应分配到大量微小的反应器中，在每个反应器中包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子( DNA模板) ，实现“单分子模板PCR扩增”，扩增结束后，通过阳性反应器的数目“数出”目标序列的拷贝数，特别适合在复杂背景中检测稀有突变。

数字PCR“分而治之”

国家食品药品监督管理总局对数字PCR的工作原理描述：对目标核酸序列定量和定性检测，用聚合酶链式反应分析法，将具有荧光定量PCR的反应物(TaqMan探针法或SYBR绿色引物法)加载到芯片上，然后用dPCR扩增仪进行热循环反应。芯片反应完成后放到dPCR分析仪上进行成像和分析，输出原始数据，将原始数据放到云端的dPCR软件上分析，并得到最终结果。仪器每处理一个芯片，只要一分钟仪器就能读完芯片。

目前市场上主流数字PCR的是三家：

1、Life Technologies 3D数字PCR（芯片式数字PCR）：可认为是微孔数字PCR，主要是将20ul反应体系分散到20000个微孔中进行反应，变成20000个反应体系，PCR反应结束后，采用CCD拍照，数阳性反应孔。

2、Bio-Rad 微滴数字PCR（油包水液滴式数字PCR）：将20ul反应体系采用液滴反应器形成20000个油包水反应体系，PCR反应结束后，才有流式细胞术的原理，检测每一个液体，数阳性反应的液滴数量。

3、RainDance 的数字PCR（油包水液滴式数字PCR）：原理与伯乐微滴数字PCR相同，但是其液体形成能力比伯乐强很多，理论上可以产生1000万个小油滴。

价格从高到底：分别是Raindance、Bio-Rad、Life Technologies。

数字PCR曾在2013年被《麻省理工大学科技评论》评为十大突破技术之一，2017年入选《世界经济论坛》评出的全球十大新兴技术，经过几年的发展，目前在国内的临床分子检测已经小规模得以运用。

2015年，国家卫生计生委个体化医学检测技术专家委员会，在广泛征求意见的基础上，制订了《肿瘤个体化治疗检测技术指南（试行）》，在此次《肿瘤个体化治疗检测技术指南（试行）》中，以QX200为技术代表的数字PCR技术，已经正式写入进去。

2016年4月，科维思在Thermo Fisher产品的基础上，申请了核心耗材的发明专利，并申请了IVD类医疗器械审批的绿色通道：芯片式数字聚合酶链式反应（DPCR）分析系统。

2017年7月27日，CFDA天津市市场和监督管理委员会已正式批准天津诺禾致源生物信息科技有限公司的数字PCR芯片阅读仪——Digital PCR NG上市[ 津械注准 20172400198 ]（与Thermo Fisher合作开发），同时，明确该仪器适用于来源于人体的血浆游离DNA样本中的T790M突变进行检测。标志着该仪器成为国内首个获食药监局批准上市的数字PCR芯片阅读仪。（CFDA可查）

2017年10月，顺德永诺成功研发微滴式数字PCR仪MiniDrop™，系我国首款拥有完全自主知识产权的微滴式数字PCR仪，并投入生产。

2017年10月31日，CFDA重庆市食品药品监督管理局正式批准重庆泛生子生物科技有限公司的生物芯片阅读仪（Digital PCR）——GENETRON 3D上市[ 渝械注准20172400136 ]（与Thermo Fisher合作开发）。在已上市取得CFDA批准的数字PCR仪器中，泛生子GENETRON 3D适用范围更加广泛，且无配套试剂盒限定。（应该是地方二类注册证，小编在CFDA没有查到，仅在重庆食药监局查到，如有错误请指正）

数字PCR在肿瘤中常用检测基因位点

实例1：比如现在有一名结直肠癌患者，手术后进行化疗和靶向治疗，想监测肿瘤的疗效和复发。医院由于病理科不愿意将组织样本外送，在没有肿瘤组织的情况下，如何检测？如果采血使用ctDNA进行突变检测，频率低于1%的话，超出绝大部分已知方法的最低检测限。此时需要进行精确定量分析，用于预判疗效和复发风险，我们可以选择用数字PCR进行检测。（KRAS野生对西妥昔单抗/帕尼单抗敏感，突变则对西妥昔单抗/帕尼单抗耐药）

两次检测，0.54%，0.58%均能检出

实例2：采用数字PCR对一例结直肠癌患者的疗效和复发进行监控，术前通过数字PCR检测有 KRAS G12A 突变，然后进行直肠切除术，术后进行了化疗治疗，一段时间后又进行数字PCR检测，此时 KRAS G12A 突变消失，在第11个月后 KRAS G12A 突变出现，而且持续升高，在第12个月检查发现肝转移，然后进行肝切除术，数字PCR继续监测，发现第16个月时候达最高峰，在第18个月检查发现发生了肺转移，此时化疗联合贝伐单抗进行治疗，然后数字PCR继续监测发现KRAS G12A 突变比例降低，后面继续监测发现突变丰度稳定没有发生其他部位转移，可见数字PCR在动态监测中是个很好的方法。（只是个例技术介绍，不要在意个例中的突变及药物，虽然KRAS突变可能对贝伐单抗耐药，但证据等级达不到临床证据等级）

数字PCR动态监测

优点：

1，灵敏度高，可检测低至0.1%的突变；

2，能够进行绝对定量，不依赖对照品或标准品；

3，操作过程简单；

4，结果分析简单。

缺点：

1，通量较低（一管最高10重反应）

2，需要特殊仪器设备；

3，适用范围较为单一；

4，检测成本较高。

此方法适宜于对ctDNA或者其他低浓度样本的低频突变进行检测，特别适用于“液体活检”。