分子技术丨FISH检测技术介绍

今天，我们聊一聊FISH检测技术，FISH是鱼嘛？FISH会发光？FISH的红绿黄点是啥？是色彩斑斓的鱼？

This FISH？（猫表示一脸懵逼）

首先，我们先了解下什么是FISH？

FISH：荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization， FISH），利用杂交的原理，用荧光染料标记探针DNA，变性成单链后与变性后的染色体或细胞核特定靶DNA序列杂交，然后通过荧光显微镜观测荧光信号位置、大小及数量来判断待测序列的缺失、扩增及易位等情况。

荧光原位杂交（FISH）

荧光原位杂交技术（FISH）是一种重要的非放射性原位杂交技术（放射性标记探针灵敏度很高，能够检测小至几百个碱基对的DNA序列，但是由于同位素的安全问题、半衰期、信号统计等限制了此项技术的广泛应用，后来逐渐发展出了非放射性标记探针原位杂交技术：直接法（荧光素/其他染料）；间接法（地高辛/生物素））。它的基本原理是：如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。

FISH检测的基本原理

常见五种FISH探针

关于FISH检测的探针，一般分为间标型探针和直标型探针：

1，间标型探针是指DNA探针先与某个半抗原连接，诸如生物素或地高辛，然后半抗原与荧光素基团连接从而形成探针－半抗原－荧光素基团，类似“三明治”的复合物。

【生物素（Biotin），地高辛（digoxigenin），二硝基苯基（DNP），aminoacetyl fluorine（AAF）等均可用于探针标记。前两者较为常用，通常采用切口平移法或随机引物法对探针标记。如两个不同的探针分别用Biotin和Digoxigenin标记，杂交后用avidin-FITC和抗-Dig-Texas-Red分别与探针上的Biotin 和Digoxigenin结合，应用双色滤光片，在显微镜下就可以同时看见带有绿色荧光的FITC和红色荧光的Texas-Red信号。同理，采用三种或三种以上不同的半抗原，如Biotin,DIG和DNP等标记探针，然后用多种不同颜色的荧光素，如FITC（绿色），Rhodamine（红色），AMA或Cascade Blue（蓝色）等结合抗体进行检测，可同时得到多种不同颜色的荧光信号，如采用不同的排列组合，最多可同时检测7种不同的探针。】

2，直标型探针是指DNA探针共价连接荧光素基团：近年来，Vysis 公司成功的生产些大片段的DNA探针（100-400kb）。由于探针较长故可将荧光物质直接标记在核苷酸上，这不仅使杂交过程进一步简化，而且杂交信号更强。与间标型探针相比，直标型探针具有低背景、高特异性的特点。随着荧光染料和荧光检测技术的不断发展，直标型探针的灵敏度也不断提高。因而在FISH检测领域，尤其是在疾病分型领域，探针大多采用直标型设计。

FISH选用的标本可以是分裂期细胞染色体也可以是间期细胞，间期细胞可以是冰冻切片，也可以是细胞滴片或印片。任何荧光显微镜均可用于观察FISH信号，但对单拷贝探针的信号需要质量较好的荧光显微镜。

FISH技术一般用于了解基因或染色体发生扩增、缺失、融合或断裂；样本来源广泛：组织、脱落细胞、羊水、血液、骨髓都可以检测，且不仅限于新鲜样本，2-3年的石蜡样本都可以检测；FISH检测在分子检测里是收费最低的而且很多地方FISH检测都进入医保可报销范畴。

在FISH中最重要的因素是温度、光照、湿度和各种试剂的PH值。温度和湿度直接影响着探针和目标DNA的杂交效率；光照影响了荧光染料的强度，因此探针要避光保存，其已经杂交的片子可用防荧光淬灭剂封片且避光保存；各种试剂pH也要精确达到要求，这也直接关系到FISH的稳定性。

目前FISH主要集中在DNA水平方面检测，而针对RNA这块比较困难，FISH 技术作为连接分子生物学与细胞生物学的桥梁地位已为世人所公认。尽管目前FISH技术无法达到百分百完全杂交，特别是在应用较短cDNA探针时存在杂交效率明显下降的问题，但随着各种新型分子探针以及更为精密高端的光学显微镜和功能强大的计算机分析系统的不断问世，上述问题将会逐步得到解决。

目前通过FISH方法可以检测各条染色体的靶标接近300余种，能够满足临床上大部分肿瘤及遗传疾病的检测需求，这还不包括一些用于科研的罕见基因靶标。

目前主要用于指导靶向药物的使用如赫赛汀（HER2）、克唑替尼（ALK/ROS1/CMET），脑胶质瘤独特类型（1p19q）等。

一般做FISH需要CEP探针，CEP检测着丝粒，CEP探针作为基因特异探针的实验对照，有其重要的意义。CEP探针也可独立用于染色体检测，可从总体上检测染色体异常情况。

比如ALK-EML4基因FISH检测：可设计两个探针分别针对ALK和EML4，可检测染色体2p23位点的ALK基因（NCBI GeneID:238）与染色体2p21位点的EML4基因（NCBI GeneID: 27436）间发生的染色体异常易位。也可以针对ALK设计一个探针，但是如果发生了融合，也不能确定是何种融合类型。（见下图）

可以设计已知融合基因的探针，比如针对ALK和EML4的，ALK全部用红色探针覆盖，EML4用黄色探针覆盖，正常就是红黄分开，融合就是红黄在一起。

可以设计已知融合基因的探针，比如针对ALK的，用红色和黄色覆盖ALK基因的上下游区域，正常就是红黄在一起，融合就是ALK发生了断裂就是红黄分开了。

 比如EGFR基因FISH检测：可用一个CEP07探针加一个EGFR基因探针，两种探针的混合物，一种探针检测EGFR基因，另一种检测7号染色体的着丝点，可特异检测位于7号染色体的EGFR基因（NCBI GeneID:1956）的异常扩增。

实例1：两名乳腺癌患者，考虑是否使用曲妥珠单抗，对HER2基因扩增进行检测。（FISH为HER2检测的金标准）

HER2的FISH检测

实例2：两名非小细胞肺癌患者，考虑是否使用克唑替尼，对ALK融合基因进行检测。

ALK的FISH检测

对于FISH检测结果的解读，一般根据探针的要求，分为以下两种：

1，数目探针：直接观察基因标记颜色进行计数确定数值或者平均拷贝数，根据不同探针说明书要求进行判断，比如乳腺癌HER2基因有明确的指南，先看比值，再看拷贝数，有一些则是直接看比值。（比如HER2：计数20个细胞，HER2红绿比值大于2，且 HER2拷贝数大于6，点状扩增阳性；HER2信号成簇，绿色CSP17信号正常，直接判读簇状扩增）

2，结构探针：先要明确异常信号模式，然后再计数各种异常信号的细胞个数占观察区域总体细胞比例，再比对判读标准进行判断。（比如ALK：计数20个细胞，出现1红1绿1融合细胞比例>15%，判读为阳性，如果比值接近15%，需要扩大计数范围；未发生红绿分离，但是出现了染色体多倍体，判读为阴性）

优点：

1，安全、快速、灵敏度高；

2，探针能较长时间保存；

3，多色标记，简单直观；

4，可用于中期染色体及间期细胞的分析；

5，可应用于新鲜、冷冻或石蜡包埋标本以及穿刺物和脱落细胞等多种物质的检测。

缺点：

1，不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降；

2，没办法准确判断断裂基因的具体坐标位置，进一步判断需要RNA seq来检测。

此方法适宜于实验室简单快速的进行基因扩增、融合及拷贝数变异的检测和评估。