中国最早从事多重流式荧光试剂开发的企业透景生命于2017年在创业板成功上市。在此之后，越来越多的企业和投资机构开始聚焦这一领域。这一领域的新兴企业，比如芯凯瑞、谱迪生物纷纷受到投资机构的青睐；中翰盛泰、东方生物等企业也在这一领域不断投入；美国多重流式荧光试剂生产企业Zeus也在常州设立工厂，开始了国产化的步伐； 在国内，部分有前瞻性的投资公司开始布局多重流式荧光赛道；流式细胞仪领域的不少创业公司，比如唯公科技、指真生物也纷纷“跨界”进入这一领域。有分析报告指出，多重流式荧光检测是暨化学发光之后，IVD行业内最受瞩目的细分领域之一。 2021年4月，美国多重流式荧光检测的领军企业Luminex公司被意大利DiaSorin公司以18亿美金价格收购，又引起了资本界及产业界对多重检测的新一轮热议。笔者近年来一直高度关注这一领域，也对Luminex的产品布局及产品管线很感兴趣，正好做一下分享。 一、Luminex的诞生：朋友、家人和Taco Luminex公司于1995年在德克萨斯州首府奥斯汀市成立。公司的三个主要创始人均是来自于德克萨斯大学西南医学中心（UTSW Med Center）的三位免疫学高材生，分别是Mark、Ralph和Jerry。此外，还有Mark的哥哥Van，一名计算机科学家，以及一名化学家唐先生。 创建Luminex公司的想法来自于前一年的一次Taco餐。1994年，在达拉斯的一家墨西哥餐厅Escondido，来自UTSW Med Center的流式细胞术教授Jack Kettman介绍了他的新想法，使用流式细胞术对不同粒径的微球进行分析，从而能对不同的生物学指标进行多重检测。 Van则建议可以使用不同颜色的微球进行编码，作为计算机科学家的他可以编辑出针对多色微球分析的算法。因此，Luminex在微球技术路线的选择上，从一开始就专注于多色编码微球这条技术路径。 从创世团队的组成可以看出，Luminex这家公司的能力拼图涉及到材料化学、免疫学、计算机科学及仪器硬件，这也决定Luminex这家公司的技术高度。 二、Luminex的微球技术 Luminex确定了微球的技术路线之后，在微球设计阶段，唐先生发现了一个问题，如果使用粒径较小的微球，如1-2μm粒径的微球，则很难包裹住足够数量的荧光染料，为了让微球有更好的分群效果，Luminex一开始就选择了大粒径的聚苯乙烯微球。 最开始的微球验证工作是在BD公司的FACScan流式细胞仪上进行的，通过在流式细胞仪上增加了一块电路板，Van写的软件可以修改FACScan上的参数设置，同时接收微球发出的信号。 经过多年研发，Luminex公司在微球开发及生产上也形成了稳定的工艺。先后开发出了多种微球，其中最具代表性的是MicroPlex聚苯乙烯微球（图1右边的微球）及MagPlex磁性微球（图1左边的微球）。 目前在IVD应用更为广泛的是MagPlex磁性微球。磁性微球的应用，使得样本的前处理更易于实现自动化。而传统的聚苯乙烯微球，则需要抽滤的方式进行清洗及样本前处理。
图1 Luminex微球示意图 在编码微球的重数上，Luminex目前通过2种或3种不同的染料，这些染料具有相同激发光波长，但发射光波长不同，因此很容易被区分开。另外，通过调整不同荧光染料的比例，可以形成100重（10*10）或500重（10*10*5）的微球矩阵，可以对几百个不同指标同时进行检测，极大的提高了检测通量。
图2 Luminex微球重数及光谱示意图 为了保证微球的均一性，Luminex微球的生产工艺也是比较复杂。以MicroPlex微球为例，简单来说可以分为两步。第一步是微球的制备，第二步是微球的染色。微球制备的步骤，首先通过分散聚合来制备种子微球，种子微球普遍粒径较小，一般为2μm左右。之后加入苯乙烯、表面活性剂及其余物质，使得微球粒径膨胀到6μm左右。 最后在聚合作用下，形成最终的聚苯乙烯微球。接下来就是微球的染色，此时微球是多孔渗透结构的，可以继续溶胀将染料及第一种溶剂吸收进微球，但由于微球存在交联结构，也使得微球不会过度溶胀。在微球吸收了染料及第一种溶剂后，再向反应体系中加入第二种溶剂，第二种溶剂可以将第一种溶剂从微球内部挤出，并将微球回缩到预期的粒径（5.6μm或6.5μm）。 三、Luminex的仪器平台 在不断升级优化微球技术的同时，Luminex同时也进行仪器的开发。 1. FlowMetrix系统 FlowMetrix系统是Luminex推出的第一款多重检测平台，其是以BD公司FACScan流式细胞仪为基础，做了部分优化而来的。这个检测系统包含一台FACScan流式细胞仪、一台个人电脑、一张数据信号处理卡以及一个基于Windows 95系统开发的软件。 FACScan是一台单激光（488nm）三色（绿色530nm、橙色585nm和红色＞650nm）流式细胞仪，可同时对64种微球进行分析。橙色荧光通道F2/红色荧光通道F3用于微球的分类，绿色荧光通道F1用于报告荧光的检测，即待测物浓度分析。 一张数据信号处理卡连接了FACScan流式细胞仪和个人电脑，用于将流式细胞仪上产生的数据高速传输到电脑上。电脑上的软件分为了两种模式，分别是“Multiplexed mode”和“data acquisition mode”，前者是自动对多重检测结果进行分析，后者则是需要手工设门及分析。
图3 在FlowMetrix系统上显示的64重微球 FlowMetrix系统的一大劣势是需要调节报告荧光F1与分类荧光F2/F3的之间的补偿，这也影响了FlowMetrix系统的推广及使用。 2. Luminex 100/200系统 Luminex团队很快发现了问题，在20世纪90年代，拥有流式细胞仪的实验室非常少，这也限制了多重检测技术的进一步推广应用。在流式细胞仪的教父之一，Howard Shapiro的推荐下（相信不少流式领域的从业者都读过他写的书《Practical Flow Cytometry》），Luminex团队开始进行仪器的研发，并于1999年推出了真正意义上的第一代多重检测平台Luminex 100，同时Luminex的微球团队也将微球重数从64重升级到了100重，因此Luminex 100这台机器能同时对100种生物标志物进行检测。特别值得一提的是，有几位华人科学家也参与了Luminex微球的优化过程。 Luminex 100这台机器包含两种激光器，分别是532nm、13-mW的钇铝石榴石（YAG）激光器，用于激发二抗/检测抗体上标记的藻红蛋白（PE），其发射波长为578nm；以及635nm、10-mW的红色二极管激光器，用于激发微球内部的两种荧光，这两种荧光的发射光波长分别是658nm和712nm，与藻红蛋白的发射光波长没有重叠，也彻底解决了困扰FlowMetrix系统的补偿问题。
图4 Luminex 100及其核心技术 Luminex 100的检测原理被业内广泛熟知，Luminex支持96孔板上样，被加样针吸上来的样本在鞘流液的包裹之下，形成单个微球的队列依次、快速通过检测部分。635nm、10-mW的红色二极管激光器，激发微球内部染料中的两种荧光物质发射出相应的两束发射光被两个雪崩光电二极管接收。 而侧向角散射光是用于设门区分单一编码微球和气泡、杂质等干扰信号。532nm、13-mW的钇铝石榴石（YAG）激光器，激发二抗/检测抗体上标记的藻红蛋白，藻红蛋白发射的荧光被光电倍增管接收。高速的数字信号处理器分析微球发出的两束发射光后，将微球进行准确定位及编号，同时定量藻红蛋白发出的荧光信号，计算出待测物的浓度。
图5 Luminex检测原理示意图 通常来讲，每种微球至少要读取100个，计算其中位值，这样才能最大程度减少96孔板读取过程中的延滞效应。 2005年，Luminex 100的升级版Luminex 200上市。相对于Luminex 100，Luminex 200 的主要优点是操作者可根据需要调节探针高度，运用Luminex XY 板操纵平台增强了检测准确性，提高了空气压缩机的性能使系统运行更加安静以及日常维护更加方便等。Luminex 200也是目前最为广泛应用的多重检测平台，不论是在科研领域还是IVD领域。 3. FLEXMAP 3D系统 Luminex公司也在持续不断地优化微球和检测平台，在2009年上市了能同时检测500重微球的FLEXMAP 3D系统。除了检测重数增加之外，FLEXMAP 3D系统还做了诸多优化和升级。首先，机器不仅能够兼容96孔板，还可以兼容384孔板，检测通量更大。 其次，首创的双进样系统可以最大程度提升分析速度，96孔板分析时间仅需要20min，相对于Luminex 200分析速度提高2—3倍，384孔板的分析时间也只需要75min。第三，配套开发的xPONENT软件不仅可以操作FLEXMAP 3D系统，并提供了实验室信息系统（LIS）和前端自动化平台的接口选项，有利于Luminex机器与自动化移液工作站的连接。 4. MAGPIX系统 Luminex平台在上市后，市场反馈良好，而且越来越多的公司及实验室基于这项技术进行试剂的开发及科研工作。但是其昂贵的机器成本，也使得一些实验室望而却步。为了解决这一问题，Luminex的第三代检测平台MAGPIX放弃了成本昂贵的流式平台，转为改为成本较为低廉的拍照平台。
图6 MAGPIX检测原理 不同于流式技术每个微球进行单独检测，MAGPIX平台一次可以对所有微球进行检测及分析，虽然分析速度略有提升，但是严重牺牲了检测性能。从分析重数就可以看出，MAGPIX一次理论上最多只能分析50种不同指标，相对Luminex 200可同时分析100种指标，还是有较大的差距。 即使其成本相对于Luminex 200有了较大的下调，感兴趣者依然寥寥无几，也没有什么IVD合作伙伴愿意基于这项技术进行试剂的开发。类似的拍照技术也被一些中小公司采用，但是受制于其性能本身，始终无法成为多重检测的主流技术。 5. xMAP INTELLIFLEX系统 在2020年，也就是Luminex公司成立25年的时候，Luminex上市其新一代多重检测xMAP INTELLIFLEX系统，该平台与FLEXMAP 3D系统一样可以同时对500种微球进行分析。另外，其新增加了第二个报告激光通道，在传统532nm激光外，还新增了第二个报告激光405nm，其对应的检测器为421—441nm。这也意味着，可以对同一个微球上的两个不同待测指标进行同时分析，进一步提高了检测效率。 从用户操作角度，xMAP INTELLIFLEX系统第一次采用了触摸屏，无需外接电脑，使得操作更加简便，也同时节约了实验室的空间。这个目前只是在科研领域使用，还尚未进入IVD市场。
图7 双报告通道及单报告通道示意图 下面是对上述Luminex不同平台的汇总及对比。
图8 Luminex现有多重平台汇总及对比 四、笔者泽楷分析 4.1 多重流式荧光技术能解决中国IVD市场的诸多痛点 笔者曾经跟医学检验领域诸多大咖，进行深度交流：专家均觉得多重流式荧光技术是一项被低估且尚未完全发挥其全部价值的技术，其逻辑在于成本低、通量高、灵活组合；在当前检验科样本量不断攀升且医保控费越来越严格的大环境，高通量且低成本的多重流式荧光技术必然会大放异彩。该系统开发难度也确实大于其他平台，具体体现在相关企业要掌握核心编码微球技术、流式荧光检测模块与全自动仪器的开发及兼容、试剂的开发及项目的组合等诸多核心能力。 而认为多重检测是重复收费、捆绑检测的论断，其实是没有掌握多重流式荧光技术的本质，那就是可以灵活组合检测指标，并不一味是大组合；多重检测和化学发光可以很好的结合在一起服务于医学实验室。 一项技术能否成功，除了商业推广之外，本质在于能否为医学实验室和患者带来价值，也就是多快好省的解决实验。全自动多重流式荧光技术，能够在检验收费红利逐渐散去之后，在收费下调、集中采购等控费手段的政策压力下，综合降低每检测结果的成本，就是cost/result, 而不是cost/test，这也符合中国医改的大方向。 4.2 必须突破卡脖子技术 说到这里，笔者不禁想说：纵使多重流式荧光检测技术是划时代的技术，但Luminex总部的商业策略也限制了这一技术被更多的合作伙伴及客户所接受。笔者的德国同事早在十多年前，就在预研基于Luminex平台的相关检测产品，认为这是一项伟大的技术，而高昂专利使用费和后续严格的采购压力，令诸多企业不能持续在这个领域探索。 笔者梳理了Luminex目前在中国地区的商业合作伙伴（见表1），大部分企业与Luminex的合作并没有达到预期的效果或者中途停止，其中的辛酸苦辣只有各位中国企业的当事人才最清楚。 图1 Luminex在中国大陆地区的商业合作伙伴
然而纵观现代科技史，在工业社会和互联网时代，一项伟大的技术不会因为人为壁垒和技术封锁而被中国人轻易放弃，不少国内企业鱼贯入场，努力攻克国外“卡脖子”技术，底层逻辑仍然是看到应用的潜力和颠覆战局的可能。 4.3 自动化解决方案 在中国，医学实验室用户的使用习惯在过去二十年已经被广泛的影响。在自动化解决方案领域，尤其是针对IVD客户的自动化解决方案，Luminex一直没有任何布局，都是Luminex的商业合作伙伴自行寻找解决方案，有的企业将Luminex 200与某些ELISA前处理站整合，有的企业与仪器设备提供商合作开发前处理管式设备。在中国市场，没有自动化解决方案，在检验科基本上是寸步难行，这块也是不少企业难以迈过去的坎儿。 4.4 李逵和李鬼 笔者在前文也提到了拍照技术相对于多重检测的经典流式技术，在成本上有了明显的下降，但是检测性能、拍照时的彼此干扰都对检测结果造成很大的影响，这也是多重检测领域的拍照技术被国内外IVD企业普遍拒绝的主要原因。 无论是化学发光，还是多重流式荧光技术，都不约而同地选择了微球做为固相载体，其原因是微球的比表面积较大，上面能包被更多的基团，用于偶联相关的抗原抗体，这也是保证试剂良好线性范围的基础。此外，磁性微球的磁吸附及分散效果非常好，使得清洗更加彻底，最大程度避免因清洗原因导至的结果异常。 但是一项由台湾人在上世纪发明、且沉寂了多年的技术，被部分企业引入国内，也被冠以“数码液相芯片”等概念。有业内同仁指出，这项技术的本质就是酶免前处理平台、微孔板条式反应设计、磁条二维码载体及相机拍照检测的混合体，其与经典的多重流式荧光技术相距甚远。 至于整个体系的表现和结果，可参考板式化学发光技术在发光赛道的表现。CAP报告显示，约55%的美国实验室采用多重流式荧光技术进行自身抗体检测，而无一家实验室在过去二十多年使用这种磁条二维码技术。不少国内外的检验界专家也对这项技术能否在IVD领域应用表示怀疑。 五、后记 围绕着Luminex这家颇具传奇经历的企业和多重流式荧光检测技术，我相信还有很多话题可以展开讨论，笔者也计划围绕相关议题多写一些文章，与行业内的各位同仁交流探讨，包括：1. Luminex营收分析；2. Luminex围绕分子诊断线的产品布局；3. Luminex的收购逻辑梳理；4. 多重流式荧光技术在免疫诊断及分子诊断的最佳应用领域等等，也欢迎大家分享出你对Luminex这家公司或者这项技术感兴趣的话题。 笔者所在的公司多年来一直在多重流式荧光这一领域埋头研发，目前已经解决多重检测的诸多核心技术难题，同时也很欣慰的看到产业界及投资界诸多同仁对这一技术高涨的热情，也希望能携手推动这项技术的进一步普及。 |
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