本文授权转自 Y生物 目前临床肿瘤基因检测产品遍地开花，不仅有包含不同基因数的大中小panel，而且针对不同的癌种还有对应的NGS产品。对于这些产品，无论是申请CAP还是注册试剂盒都需要一份完整的验证报告，今天，小编总结下肿瘤NGS产品验证报告的基本思路。 一份验证报告包含了较多内容，小编将会分三个部分进行总结介绍： （上）：一些基本概念和实验参数，分析参数的总结； （中）：性能分析的总结； （下）：参数的补充和注意事项。 首先对 一些基本概念和实验参数，分析参数的总结进行如下展开： 明确目的 一份完整的验证首先需要明确此次验证的目的，以及产品名称，包含的基因等。 明确验证的项目 需要明确验证的包含的内容，比如SNV（单核苷酸变异），INDELS（小片段的插入和缺失），CNV（拷贝数变异），fusion(基因融合/重排)，还可以包含TMB，MSI等项目。 明确验证测序方法 需要明确测序方法和测序的仪器。 基础内容描述 对设备需求，软件，试剂，供应商和存蓄的一个简单描述。主要内容如下： 样本的制备 为了获得足够DNA量进行试验，对样本的量和肿瘤纯度都有要求，以FFPE样本为例，目前市场上的要求是5-20张厚度10微米的无污染切片，肿瘤纯度最少10%（小于可能需要刮片等处理）。样本中提取的基因组DNA，一般需要对DNA进行质检，DNA的量在100-250ng，片段长度在~200bp。如果打断后的样本不直接用于建库，需要存在在-20℃的冰箱保存，DNA在37℃能够保存10-20min，在2-8℃能够保存24h，在-20℃能够长期保存。 预杂交文库的制备 简述打断后的DNA建库用的试剂和步骤，需要的预杂交文库的量，下图是MSK验证报告的简述：
测序和数据拆分 简述测序仪器和数据拆分软件和下机数据的Q30。 杂交捕获 简述杂交捕获需要的探针供应商，以及杂交捕获的基础步骤，捕获文库的片段大小，总量，下图是MSK验证报告的简述：
生信分析流程 DNA的测序数据的质量，是由多个质控过程进行检测的。 1） 数据管理平台，用于样本的追踪和溯源； 2） 数据的拆分和FASTQ文件的生成； 3） 简述序列的对比和BAM文件的生成步骤； 4） 简述样本质控的标准，包括样本是否配对，样本是否污染，正常样本中是否有肿瘤体细胞突变等； 5） 突变检测 – SNVs and Indels: 分析流程检测两种类型的突变：1）单核苷酸变异（SNVs）2）小片段插入和缺失（INDELs），拷贝数变异（CNV），基因重排，简述突变检测的阈值，下图是MSK验证报告中的筛选标准。
6）突变注释：简述注释数据库； 7） 简述TMB和MSI等的原理方法和阈值。 质控 1） 配对正常样本的质控，简述患者的配对样本的标准，当配对样本的失控，处理方法； 2） 阳性质控，简述阳性质控品的标准及包含的突变类型，下图是MSK验证报告中的阳性质控样本表：
3）阴性质控，简述阴性质控品的标准。 报告结果 1） 肿瘤PANEL是按照一定规则进行结果输出的，根据临床证据等级划分，可把结果定义为（1）具有明确临床意义的突变点；（2）具有潜在临床意义的突变点； 2） 详述样本报告结果的质量指标，包括平均覆盖度，测序碱基质量，突变阈值，污染的判断标准等。 小编这次整理结束，后面会继续整理性能验证的模块，敬请期待。 |
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