诊断技术｜纳米抗体，诊断用抗体新贵

像“C05”这样的抗体主要通过VH结构域和主要的扩展CDRH3来介导结合，只有CDRH1的少量贡献，这在蓬勃发展的纳米抗体领域是很有趣的。

鉴于哺乳动物免疫球蛋白强制性异源二聚体的超域复杂性，直观地说，如果VH和VL结构域独立表达，由于有暴露的疏水界面区域，它们将是不稳定的，容易聚集。

因此，这种反常现象在人类中极为罕见，尽管至少有一例稳定的抗黑色素瘤的VH抗体，它是通过噬菌体展示从一个接种过疫苗的病人身上分离出来的，而且Domantis公司（现在是GSK的一部分）已经将自己定位为人类单链域抗体（DAb）平台的开发者。

骆驼科动物（骆驼、美洲驼和羊驼）产生了一类“仅有重链”的抗体，其结合是通过被称为“VHH”的未配对的可变重结构域介导的。

传统的人类和小鼠的V结构域是通过异构化来稳定的，而VHH结构域的特点是有一系列标志性的替换，在传统IgG中对应于轻链异构化部位的区域有更多的亲水性。

这转化为更好的可溶性表达，这一特点使VHH结构域库成为利用和挖掘天然和合成骆驼类抗体多样性的非常有效的手段。

围绕这些类型的单结构域抗体的兴奋点主要来自于它们的稳定性和对多种异源表达系统的适应性，以及它们令人印象深刻的重新折叠以重现原生亲和力的能力。

然而，就像每一类抗体一样，由于热力学异常可能发生，所以做出这样的概括是很危险的[36]，并且已经努力确定一个更合适的通用VHH候选框架（例如cAbBCII10）来赋予嫁接的VHH CDRs更好的热力学特性。

这种改进的热力学特性在诊断方面将有很大的好处。同样有趣的是，它们往往有一个长的CDR3，与它们所提出的裂隙结合倾向有很好的关联。

用保龄球来比喻是很诱人的，传统的IgG或scFv/Fab异构体被认为是以“阿特拉斯”式的杯状方式与它们的目标接触，而VHH则是以空腔为目标。

然而，在典型的溶菌酶活性位点结合VHH的情况下，尽管CDR3非常明显地询问了结合位点，但VHH和传统的异构体Fv元素对溶菌酶的抗原界面面积实际上是非常相似的。

我们可以合理地推测，这样的CDR3突出会不利于合子的结合。

然而，有几个报道的结合合剂的VHH抗体的案例，如针对（公认的，一个相当大的）铜络合偶氮染料化合物的抗体，还有原型合剂，甲氨蝶呤。

现在看来，甲氨蝶呤的结合很可能是由一个隐秘的结合袋介导的，该结合袋是由一个非变异性的环状区域产生的，与假设的CDR4元素一致。

这种协调的相互作用机制可能意味着VHH提供了比最初想象的更大的结合潜力，特别是考虑到它们在高浓度溶剂中的明显重现能力，这在环境和食品样品中合剂污染物的一般样品提取协议中经常出现重大的复杂性。

鲨鱼新抗原受体免疫球蛋白（IgNAR）包括一个二聚体、非异构化的可变域成分（VNAR），这必须被归类为趋同进化的典型例子。

VHH是哺乳动物IgG的真正后裔，而IgNAR则是独立产生的，它本身就是一种独特的同型。VNARS的大小约为12kDa，是能够独立结合抗原的最小的纳米抗体。

有理由相信，由于它们的体积小，轻链变异少，以及随之而来的有限的多样性，它们更经常地采用长CDR3环，这些环的多样性非常严重，甚至在初级剧目水平上，由4个重排事件引起，与高阶哺乳动物的转录器介导的多样性不同。

与VHH相似，它们保留了不变的标志性半胱氨酸残基，通常与额外的CDR1和/或CDR3桥接半胱氨酸残基一起（图4）。这些赋予了结构多样性的额外水平，也有助于VNAR结构域的明显稳定性。

尽管传统的mAbs已被证明可以结合可比的裂隙区域，但似乎VNARs和VHHs对裂隙结合有明显的偏好。VNARs与同族抗原复合物的晶体结构测定优雅地证明了这一点，也初步表明可能涉及到诱导性的配合结合机制。

图4|重新排列的骆驼和鲨鱼可变重域的结构蓝图示意图。抗原结合区由高变异区（HV）组成，在给定的位置上插入氨基酸的倾向是高度多样化的，这些HV区的两侧是氨基酸多样性减少的区域，这些区域被称为框架（FW）区。除了经典的半胱氨酸桥（红线），鲨鱼和驼鸟的可变重链都表现出非经典的分子内二硫化物连接的半胱氨酸残基。

从诊断的角度来看，使用VNARs有明显的优势。鲨鱼与哺乳动物的系统发育距离已被证明在针对难缠的哺乳动物抗原方面有价值，这是另一个关键的固有优势。

在鲨鱼血清的高渗透压和350 mM尿素环境中循环和持续存在的二硫稳定结构域的内在稳定性，在现场应用中可能是非常有益的，也可能对试剂的保质期和护理点的完整性产生有利的影响，特别是在低资源环境中。

当共价固定在生物传感器表面时，VNARs保留结合功能的能力对于易于表征、开发基于生物传感器的诊断测定和标签的化学连接具有重要意义。

相反，scFv分子往往不能容忍这种掺杂物，化学连接或固定化经常导至功能的消减（人员观察）。再加上方便的异源表达，可以理解的是，VNARs被视为合法的试剂，以诊断上相关的分析物为目标。

鲨鱼和骆驼的纳米抗体最近都被评估用于埃博拉病毒的检测，而且很可能用于现场应用的便携式生物传感器的开发可以极大地受益于这一类目前未被充分开发的热力学上的纳米抗体。

重组抗体能够很容易地模块化、亲和力成熟、格式化并在异源表达系统中轻松表达，这使得重组抗体成为应对现代诊断挑战的丰富资源。

在高亲和力和特异性几乎被认为是理所当然的时候，重组抗体提供了许多额外的固有优势。它们的小尺寸可以被用于成像应用，在这种应用中，较短的半衰期和组织穿透力是必要的特征。

可以很容易地设计和互换融合标签或标记，以促进检测或化学修饰或定向固定的特定位点连接。与整个IgG相比，它们的分子足迹最小，可以减少由异性抗体、补体参与或其他虚假的Fc相互作用产生的检测干扰，这些干扰可能会影响临床样本的分析。

使用整体的方法，有可能制造出针对几乎所有目标分析物的抗体。

关键是要清楚地知道自己在终点检测中需要什么，并将生成策略（如免疫或合成，小鼠或鸡）和选择（如偏向于高亲和力、类交叉反应性、缓慢的脱落率或低pH/高温下更好的热力学稳定性）标准建立在对目标分析物和设想的终点的全面了解上。

一个有用的口号是知道分析物是什么，知道需要检测多少，以及在什么情况下需要检测。现在，成功提供这些强大的试剂的方法已经确立。