荧光原位杂交(FISH)前处理实验步骤详解及案例分析

1. 标本的类型

（1）手术切除标本；（2）粗针穿刺活检标本；（3）麦默通活检标本；（4）大于100个癌细胞的细胞学标本。

2. 标本的固定

所有乳腺癌标本离体后都应尽快固定（1h内）。固定时应将标本每隔5～10mm切开，并可在组织间嵌入纱布或滤纸等物。固定液量与所浸泡组织的比例应足够。固定时间以6～72h为宜。

3. 固定液类型

3.7%中性（磷酸缓冲）甲醛固定液。

4. 切片厚度

以4～5μm为宜。

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对标本的要求来源于《乳腺癌HER2检测指南（2019版）》。需要注意：

1.标本固定的两个时间点很关键。一要及时固定（1h内）。固定不及时，细胞发生自溶，DNA降解，DAPI下观察，标本呈现核很浅，甚至有糜烂现象，信号无或缺失严重。二要注意固定时间以6～72h为宜。对于小的穿刺标本，建议固定6-24小时，而手术切除的大标本以24小时以上为佳。

2.切片厚度影响。切片太薄（实际厚度<3um），容易消化过，且信号出现很大比例的丢失，影响结果判读（图1）；切片太厚（实际厚度>5um），难于消化，容易出现高背景，信号层面增多影响观察判读（图2）。

图1 切片太薄FFPE样本杂交图（HER2探针，Ｘ1000倍）

图2 切片太厚FFPE样本杂交图（HER2探针，Ｘ1000倍）

1. 玻片预处理

1.1 玻片放入65±5℃恒温箱中烤片过夜；【使组织细胞紧紧粘附，后续洗涤等处理时不至于脱落；烤片后立即脱蜡，可减短脱蜡时间、增强脱蜡效果，烤片不短于两小时。】

1.2 取出玻片，将其放入二甲苯中室温脱蜡30分钟；【相似相溶原理，可用环保试剂代替二甲苯。】

1.3 取出玻片，再将其放入另一缸二甲苯室温继续脱蜡10分钟；

1.4 取出玻片，再将其放入无水乙醇中室温10分钟；【去除残留二甲苯。】

1.5 取出玻片，再将其放入100%、90%、70%梯度乙醇室温复水各3分钟；【梯度复水，细胞进入水环境，为煮片及酶消化作准备。】

1.6 取出玻片，再将其放入灭菌纯化水中室温洗涤3分钟，用无绒纸巾吸取多余水分；【使细胞进入100%水环境，为之后煮片做好准备。】

1.7 取出玻片，再将其放入灭菌纯化水中100±5℃煮片20分钟（切片水平放置于容器中，样本面朝上）；【（高温处理能去除蛋白交联，DNA裸露出来，同时使细胞胀大，组织蓬松，有利于酶消化、后续杂交和杂交后观察，煮片也可以用EDTA溶液或NaSCN 溶液代替水，这样煮片会更剧烈，适用于比较致密的组织）；（煮片时间不够，蛋白交联没有充分去除，后续延长消化时间也很难补救过来，比如外院送检的标本固定过了，需要更长时间的煮片；而一些细胞密集的样本，比如淋巴瘤，煮片时间过长，细胞核粘连严重，影响计数判读。）】

1.8 取出玻片，室温晾干；

1.9 再将玻片放入37±1℃预热的蛋白酶反应液中消化8～18分钟；【（消化组织和细胞上的蛋白质，有利于探针进入杂交，且降低背景；消化效果可在显微镜下观察，消化时间）；（福尔马林固定石蜡包埋的组织需要用蛋白酶进行消化以去除多余的组织来暴露细胞。如果消化不足，比如：酶浓度低、温度不适合、时间太短等情况，镜下会出现云雾状组织覆盖在细胞上，无法观测到暴露独立的细胞核，从而降低杂交效率并很难选择细胞进行计数；如果消化过度，则细胞核被损伤，失去正常的圆形完整形状，变得支离破碎，甚至像鬼影一样。）】

1.10 取出玻片，再将其放入2 × SSC 中室温洗涤5分钟；【终止酶消化，洗去消化产物。】

1.11 取出玻片，再将其放入另一缸2× SSC 中室温洗涤5分钟；【进一步洗涤，洗去杂质，有利于探针进入杂交，降低背景。】

1.12 取出玻片，再将其依次放入70%，90%，100%梯度乙醇室温脱水各3分钟；【为后续探针杂交制造无水环境,若洗涤后对光观察，玻片上仍有沙沙的杂质，可能是SSC盐残留，会引起背景高，信号容易淬灭等情况。建议在70%乙醇中多洗几分钟，或洗涤过程中摇晃。】

1.13 取出玻片，室温晾干。

2．样品和探针同时变性（避光操作）

2.1 从-20±5℃冰箱中取出杂交液（粘稠液体），震荡混匀，瞬时离心；

2.2 加10μl的杂交液到杂交区域，迅速盖上22×22mm盖玻片，轻压使杂交液均匀分布，避免产生气泡；【空气存在会影响到杂交效果，氧分子是引起荧光淬灭的一种淬灭剂，高温能促进其作用。】

2.3 用橡皮胶沿盖玻片边缘封片，完全覆盖盖玻片和载玻片接触的部位；【封闭形成局部干燥。】

2.4 将玻片放在85±1℃的热台上，变性5分钟；【温度不够，变性不充分，杂交率低而且信号弱；温度过高，可能导至细胞核糜烂；不同公司的探针可能变性的条件不同，不建议用其他公司的条件做安必平的探针，因为此步骤为关键步骤。】

2.5 将玻片放入预热的湿盒或杂交盒中，避光，37±1℃孵育过夜（10～18小时，需要合适的湿度，太干或太湿都可能影响红绿信号的亮度。）

3．杂交后洗涤及复染（避光操作）

3.1 将玻片取出，轻轻撕去橡皮胶，移去盖玻片（若盖玻片难以去除，可以将其放入洗液I中微微摇晃，以利于其脱落。）；

3.2 玻片放入洗液I中37±1℃孵育 10分钟；【洗去多余未杂交和非特异性性杂交的探针，降低背景，去除非特异性信号点。】

3.3 取出玻片，再将其放入洗液II中37±1℃孵育 5分钟；【加强洗涤效果，去垢剂NP-40对细胞膜作用强，对核膜作用弱，背景更干净。】

3.4 取出玻片，再将其放入室温70%乙醇中脱水3分钟；【洗去SSC等盐类物质，加快干燥；建议此步骤用到的70%乙醇每次都更换新的。如果在南方比较潮湿的季节，也可考虑继续过90%和100%酒精，保持干燥有利于之后的DAPI染色。】

3.5 取出玻片，暗处自然干燥玻片；（滴DAPI前要充分干燥。）

3.6 室温，滴加10 μl DAPI复染剂到22×22mm的盖玻片, 载玻片目标区域朝下，轻放于盖玻片上，轻压，避免产生气泡，在暗处存放，待观察。

上述就是FISH FFPE样本的实验原理。

了解了FISH实验流程和其中的注意事项，已经解决了90%的FISH杂交困境。但在实际阅片中，可能还是会遇到一些影响判读的状况，例如，视野内杂质较多、信号点不够亮或荧光淬灭等，小编接下来继续带大家梳理常见的问题。

1.  不合适的洗涤

如果洗涤时间不足或溶液温度不够，则容易出现背景荧光。在洗片之前必须用温度计来测量溶液的温度。一次洗片不超过10片，如果有超过10片切片被洗涤，必须分次洗涤，在每次洗涤前再次升温并测量温度。

2.  自然发生的背景

石蜡切片中一些明显的背景荧光可能会迷惑经验不足的观察者。首先要忽略粒细胞可能发出的明亮荧光，其次红细胞在各个荧光通道都会发出荧光。单个的荧光点比较麻烦，但可以通过切换不同荧光通道来辨别，它们通常在各个通道都会发光，不要总是覆盖核信号并尝试更严格的定义这些点。背景信号有可能位于比正常FISH信号更高的平面上。

图3~图6列举了一些常见的背景荧光，供小伙伴们参考。

图3 背景荧光点（SYT探针，Ｘ1000倍）

黄色箭头指示绿色的背景荧光点。这些点可能比正常的荧光信号大，有更清晰的边缘。在各个荧光通道都发光且颜色更深。有很多背景斑点的区域应该尽量避开进行观察。

图4 绿色背景（淋巴瘤MYC探针，Ｘ1000倍）

在该区域可见到高水平的绿色背景，应该避免检测这种区域。使用窄通道的，专为探针设计的滤光片可以有效降低这种背景。增加蛋白酶消化时间和更强烈的杂交后洗涤也可能有用。

图5 高自发荧光（BCL2断裂探针，Ｘ1000倍）

强烈的绿色自发荧光导至绿色信号和核边缘难以被检测。这种标本应该增加蛋白酶消化时间。

图6 红色杂点（HER2探针，Ｘ1000倍）

该乳腺癌标本的红色杂点又大又多，看起来非常像HER2成簇扩增，实际上认真观察可以发现，这些红点大部分都不在细胞核内，而且信号亮度大小都和正常信号有着很大的区别，这种非常亮的自发光杂质不是这么容易通过洗涤去除，但是因为和信号点区别很大，可以在判读时自己区分。

由于组织固定、DNA暴露、蛋白酶消化等因素，FISH信号可能过弱（图7）而难以检测，可以通过增加DNA暴露、蛋白酶消化和杂交时间来解决。下面由小编一一介绍。

图7 弱信号（HER2探针，Ｘ1000倍）

1. 不适的组织固定和包埋

许多因素可能导至组织保存的问题。建议使用商品化的中性福尔马林固定液以获得好的杂交效果，对于批量性的无法满足FISH检测的标本，建议首先考虑改变样本的固定条件。

2. 不合适的DNA暴露

不合适的DNA暴露（用压力锅或化学试剂）是导至信号弱的重要因素。如果信号弱，建议增加压力锅或化学试剂处理的时间（图8），或者延长酶消化时间（图9）。

常规水煮，消化5分钟高压锅水煮，消化5分钟

图8 煮片方式对杂交信号的影响（DDIT3断裂探针，Ｘ1000倍）

左：水煮25分钟，消化4分钟  右：水煮25分钟，消化13分钟

图9 消化时间对杂交信号的影响（SYT断裂探针，Ｘ1000倍）

3. 变性/杂交条件影响

核酸变性杂交有明确的温度要求，但有时受环境温度、热台表面实际温度等影响，变性和杂交的温度并未达到设定值。在实验过程中可以通过延长变性时间或适度提高变性温度，调整杂交温度和时间（图10），改善FISH探针的杂交结果。

左：杂交4小时     右：杂交12小时

图10 杂交时间对信号的影响（乳腺癌HER2探针，X1000倍）

4. 不合适的滤光片和光源

滤光片对于信号的强弱具有重要作用，尽量避免非探针制造商指定的滤光片。滤光片的效果会随着时间下降，因此也需要注意更换老化的滤光片。

汞灯一般使用200-300小时后，光源强度会减弱，此时应该及时更换。

5. 探针问题

使用超过效期的探针进行实验，未按标准用量或探针未布满盖玻片时会影响杂交效果。

此外，探针需按厂家要求的温度进行避光保存。

6. 气泡

杂交时，样本区上盖玻片与样本间的气泡会导至弱信号及无信号。量取杂交液时需轻柔，可短时离心后再进行量取；可以在盖上盖玻片后轻轻敲击，以减少气泡；当气泡已经产生，可以轻轻按压盖玻片，将气泡“驱赶”。气泡也可能因为切片表面不平整而产生，可以移动盖玻片到较平整的地方，或移去盖玻片并增加探针量。

以上就是小编今天的全部内容了。希望能够让从事FISH的老师们对FFPE样本处理有一个更清晰的了解和认识。对于没有涉及的内容，欢迎大家留言提问，也许就是下一期“样本处理”的题目。最后，奉上一组美美的FISH杂交图。