诊断技术｜引物的设计——检测的特异性、稳定性和扩增效率

在大多数情况下，引物设计的目的是最大限度地提高PCR的特异性，这是由许多变量或多或少可预测的影响决定的，其中一个重要变量是引物3’端的序列。

重要的是，为特异性而设计的PCR测定更有可能在宽的动态范围内保持高效率，因为该测定不会产生非特异性的扩增产物，从而竞争PCR试剂或抑制主扩增反应。

当然，在有些情况下，特异性不是最重要的，例如，当目的是量化密切相关但有差异的病原体时，就需要特殊的设计、优化和验证标准。

溶解曲线是评估扩增子特异性的标准方法，至少在是否扩增单一目标方面是如此。然而，必须强调的是，溶解曲线可能具有误导性，因为例如，它们可能受到次优引物和低模板浓度的共同影响。

图5 | 熔解曲线显示了从两个针对不同数量的两个目标DNA的检测中得到的Tm转移。

A、在较高的浓度下（a-d）），qPCR测定完成后没有明显的引物二聚体。随着模板浓度降低到50拷贝（e），一个非特异性产物开始出现，在最低浓度时成为唯一产物（f）。

B、该检测在所有目标浓度下都记录了相同的Tms，即使在最低浓度下（5拷贝）也没有明显的引物二聚体。使用这两种检测方法时，在NTCs中都没有检测到扩增产物。

图5显示了用模板以不同浓度存在的样品得到的溶解曲线。图5a显示，在两个最低的浓度下，产生的非特异性扩增产物的Tms比特异性扩增子低。

显然，这种检测方法不能可靠地用于检测存在于低浓度的目标。

有趣的是，NTCs，即完全没有DNA存在的样品，没有记录（非特异性）扩增产物，表明背景基因组DNA可以参与非特异性扩增/聚合作用。

有时这种背景引物和非特异性扩增是无法补救的，但往往可以设计出在任何模板浓度以及NTC中都没有非特异性扩增的检测方法（图5b）。

在这里，即使是记录Cq为35的目标浓度的扩增，也会产生一个特定的溶解曲线。同样，NTCs没有显示出非特异性放大的迹象。有时，检测行为可能是依赖于母液的，只有在某些缓冲液组成中检测到非特异性扩增，可能与不同的Mg2+浓度有关。

Ta的优化是qPCR检测的经验验证和优化过程中的一个有用步骤。它通过显示产生最低Cq而不扩增NTC的温度（或温度范围），提供了一个引物组稳健性的直接指示。

灵敏度的两到四倍差异对针对高表达mRNA的人来说可能并不重要，但对诊断性检测来说，它可能意味着阳性和假阴性结果之间的区别。

qPCR引物的Ta特性可能差别很大。有些检测不是很稳健，如果不是在引物的最佳Ta值下进行，就会很快崩溃。

这一点很重要，因为这类检测在现实世界中往往也是有问题的，样品的纯度、DNA浓度或其他DNA的存在都可能不是最佳的。

此外，目标拷贝数可能在很大的范围内变化，试剂、塑料器皿或仪器可能与建立检测时所用的不同。

图6|温度梯度显示了PCR检测的不同稳健性。

A、使用Bioline的Sensifast SYBR mastermix（目录号BIO-98050）对从人脑RNA制备的cDNA进行PCR的方案。

B、使用Bio-Rad公司的CFX qPCR仪器对阿帕林（NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG）进行扩增图和溶解曲线记录。

C、ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG)的扩增图和熔解曲线。

D、GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC)的扩增图和溶解曲线。

E、在不同的退火温度下记录的Cqs，显示了在7C温度梯度下记录的Cq的差异。

图6显示了一个不理想的检测的典型结果，其中qPCR使用59 C和67 C之间的梯度Tas（图6a），使用针对三个人脑特异性基因的引物进行的。

从扩增图中可以看出，Opalin引物远非理想，因为它们的最佳Ta范围很窄（图6b），也就是说，Cqs被广泛分散，导至Cqs与它们的最佳Cq相比明显偏低。

这种检测方法不稳定，很可能导至次优扩增，因此，应该重新设计这对引物。此外，溶解曲线分析（插图）表明，这种检测方法的特异性也可能存在问题，因为每个Ta的溶解曲线都不一样。

图6c所示的ACSBG1检测方法比上面的Opalin检测方法更稳健，但仍远非理想，很可能还可以改进。

然而，我们强调，稳健性和特异性没有必然的联系，因为这种检测方法产生的溶解曲线在所有的Tas都显示出相同的峰值（插图）。

另一方面，稳健性检测的容忍度要高得多，在广泛的Tas范围内产生类似的Cqs，如图6d所示的GFAP检测。

在相同的8摄氏度范围内得到的Cqs相差不到1，溶解曲线（插图）证实了该温度范围内的检测特性。值得注意的是，计算的Tas和实际的Ta范围可能有很大的不同。

有许多旨在帮助研究人员设计高效引物的指南，大多是基于长期以来建立的规则，并对引物的3’端给予了很多关注。经常给出的建议是在3’端包括一个G或C，并且有两个G或C碱基（GC钳），但最后5个碱基中不超过两个。

在实践中，这些规则可以指导研究者，但不一定在任何情况下都是正确的。

图7 | 引物3’端对特异性或效率的影响极小。

A、针对人类HIF-1α（NM_181054.2）基因的引物的位置。

B、使用安捷伦Brilliant III SYBR Green母液（目录号600882）扩增六个检测项目的方案。

C、由Bio-Rad的CFX qPCR仪器和3’端引物记录的扩增图和溶解曲线。NTCs显示为红色。

D、每个检测项目的Cqs记录

例如，图7中的结果与3’端规则相矛盾，所有设计产生的结果基本相同，只有两个引物组合在NTC中导至非特异性扩增。

然而，我们不能支持GC夹的影响，因为在这种情况下，将A或T作为最多30个碱基并不会降低特异性。

试验C，其中F引物以GGCC结尾，确实在NTCs中记录了Cqs，表明人们可能想在30-末端避免这些序列。我们强调，确定引物对的最佳3’端序列的唯一方法是对一些候选引物进行实验的评估。

重要的是，虽然非特异性的PCR检测永远不可能成为特异性的，但扩增效率可以通过改变酶、母液、添加剂和循环条件以多种不同的方式进行调整和最大化。

评估PCR检测的效率最好使用目标核酸的10倍或5倍的连续稀释液，即“标准曲线法”。

如果使用PCR扩增子或合成DNA目标来生成标准曲线，这些目标的连续稀释液应与恒定数量的背景DNA（如基因组DNA）混合。

图8 | 稀释曲线评估PCR的效率。

A、使用针对HIF-1的引物：F：AAGAACTTTTAGGCCGCTCA和R：TGTCCTGTGGTGACTTGTCC和Agilent的Brilliant III SYBR Green mastermix（目录号600882）进行PCR和融化曲线条件。

B、100 ng RNA被逆转录，稀释2倍，将连续稀释的cDNA样品稀释5倍到1 ng人类基因组DNA。熔解曲线显示在插页中。

C、对第二个cDNA样品重复RT反应、稀释和连续稀释，结果相似。

图8显示了两条标准曲线，在两个不同的cDNA样品上使用相同的检测方法，结果是效率相当，约为100%，R2值也相似，即实验数据与回归线的拟合程度或数据的线性程度。

两条标准曲线具有可比性，但并不完全相同，如果目的是准确量化目标，那么必须注意的是，提供拷贝数计算而不说明不确定性是不可接受的。

图9 | 与使用标准曲线进行量化相关的测量不确定性。

A、使用针对GAPDH（NM_002046）的引物进行PCR和溶解曲线条件。F：ACAGTTGCCATGTAGACC和R：TAACTGGTTGAGCACAGG和Bioline的Sensifast SYBR mastermix（目录号BIO-98050）。

B、用Bio-Rad的CFX qPCR仪器记录的扩增图、溶解曲线和标准曲线。

C、标准曲线图和95%的置信区间（CI）。

D、从稀释曲线中得出的三个Cq值的拷贝数和95%的置信区间。

图9显示，对于一个优化的检测，单一标准曲线的固有变异性，大约是2倍（95%置信区间，最小到最大），这可能是可以预期的最小变异性。