Nature | 单碱基高分辨率革新技术MCC，可用于碱基对层面的基因互作研究

2米长的DNA如何装进直径只有10微米的细胞核？我们体内几乎所有的细胞都完美解决了这个储存难题，无数科学家也对此表现出浓厚的科研兴趣。研究发现，在细胞核中DNA以一种非随机的方式进行DNA折叠，这种模式影响着许多基因组功能，包括调节大约20,000多个基因的表达。

近日，英国牛津大学拉德克利夫医学研究所Doug R. Higgs和James O. J. Davies领导的研究团队在Nature上发表了题为“Defining genome architecture at base-pair resolution”的文章。研究团队开发了一种监测基因组3D结构的方法，能在DNA单碱基对水平上精准定位基因组内的DNA互作，为基因表达、调控的研究提供了新思路，也为未来的基因组3D研究开辟了无限可能。 

人类以及其他多种生物已经进化出精准调控基因表达的复杂机制。控制基因表达的核心是DNA的短调控序列，即增强子。增强子在人体基因组中非常丰富，多达81万个。增强子与转录因子相结合，转录因子继而通过识别6-12个碱基对的DNA短基序（motif）来调控基因表达。但有的增强子距调控基因有很长的一段距离，这些增强子如何调控基因表达成为一个非常有趣且重要的研究课题。目前获得广泛认可的观点是，通过DNA折叠的特定模式拉进增强子和调控基因的空间距离，使得转录因子能够刺激基因表达。

染色体构象捕获（3C，chromosome conformation capture）技术彻底改变了基因组3D结构的研究，研究人员可借助3C技术推断不同DNA区域之间相互作用频率，并发现增强子-基因的相互作用优先发生在细胞核内拓扑结构域（TADs）内。TAD被认为通过拉进基因和增强子的距离来解决基因边界问题，从而提高增强子和基因匹配的概率。但到目前为止，3C技术还无法在碱基对水平上确定基因和增强子之间的物理接触。为解决这个难题，James O. J. Davies等人开发了一种微捕获C（Micro-Capture-C，MCC）技术，提高了基因与增强子互作的监测分辨率。

图1.基因组折叠的环挤压过程，图片来源：Nature

研究人员通过对已有的3C技术进行关键性的技术改进，显著提高了DNA互作的识别分辨率。据文章介绍，MCC技术使用MNase（micrococcal nuclease）核酸酶作为DNA分子剪刀，可实现随机片段化DNA且不依赖于DNA识别序列，产生的DNA片段比序列特异性核酸酶产生的片段短，因此分辨率也得以有效提高。结果表明，MNase基本没有碱基偏好性，相比于压缩紧实的DNA，MNase仅对压缩略松的DNA（该片段有正在表达的基因）表现出轻微的剪切偏好性。 

图2. DNA环挤压导至CSR（class-switch recombination）基因重排，图片来源：Nature

研究发现，MCC产生的互作DNA连接区DNA片段较短并且可以确定片段的完整序列，意味着捕获的基因位点确切位置也是已知的。因此，MCC可以使碱基对落在DNA互作连接处，实现DNA表达调控的精准监测，实现染色质捕获的质的飞跃。此外，DNA蛋白结合位点受到保护不会被MNase剪切，所以该MCC技术还可以检测到DNA结合蛋白的“足迹”。

研究团队将MCC技术应用于胚胎干细胞和小鼠前体红细胞进行三维基因组折叠研究。值得注意的是，增强子、基因和CTCF结合位点之间的互作区域呈现为高度局部化的尖峰信号，与3C呈现的广泛互作信号有本质化的区别。与既往结果一致，基因间的离散互作基本发生在TADs中（大约87%的时间）。MCC分析结果证实，精准互作多与细胞特异性表达相关，细胞特异性与转录因子的结合有关。若增强子-基因互作区域中心的转录因子结合位点发生突变，MCC技术的检测信号会出现局部丢失现象，同时检测到基因表达下调。以上结果提示，转录因子有助于维持高度特异的三维基因组折叠模式，这些模式参与了转录控制过程。 

不同类型细胞中的CTCF结合位点在基因组上的位置基本相同。研究人员发现，当DNA中间区域有较多活跃转录基因和增强子时，CTCF与DNA结合位点的接触机会增加。此外，研究发现cohesin和一种名为Nipbl的蛋白质（可将cohesin装载到DNA上）在活性基因及增强子处更容易富集。这些数据支持了理论模型：当细胞特异性的cohesin加载到活性基因和增强子上时，DNA环挤压向非细胞特异的CTCF“路障”位点移动。这一理论与既往研究非常吻合，即cohesin有助于增强子-基因间的相互作用。 

图3. cohesin对于基因TAD结构的重要性，图片来源：Nature

MCC方法将已有技术整合为该领域长期以来翘首以待的技术：一种可以精确确定具体哪些DNA碱基在介导基因组远距离互作的技术方法。这一改进使我们能够对基因调控过程进行高分辨率的解析，包括多个基因和调控元件的复杂基因组区域，以及近距离（少于20kb的DNA）增强子-基因间的互作。此外，对于调控蛋白如何建立和维持3D基因组结构的研究，高碱基对分辨率的MCC也将成为一种强有力的工具性技术。

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