“分子诊断万花筒”经验篇-如何利用LAMP引物设计平台设计IMSA引物

IMSA，全称为isothermal multiple-self-matching-initiated amplification，中文名为等温多自配引发扩增。该技术的详细介绍可见本公众号历史文章：“分子诊断万花筒” 开篇——等温多自配引发扩增技术简介。在这里隆地熊为大家介绍一种如何利用LAMP引物设计平台去设计IMSA引物的方法。

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在进行引物设计前，通过比对软件获得所测基因的保守序列是必不可少的前提。这样做的目的是排除物种特异性，防止交叉反应。如何获得基因的保守序列，具体操作可见“分子诊断万花筒”小白篇——如何设计PCR引物（一）。

     当获得保守序列后，可以利用LAMP引物设计平台进行IMSA引物设计。当然，也可以根据IMSA引物设计的原理，利用PCR引物设计软件进行设计。但个人建议选择前者。为了方便阐述，本文以设计针对EV71VP1基因检测的引物作为例子。

1. 建立EV71VP1 gene.txt文件，将所获得的保守序列复制粘贴到其中。

2. 打开LAMP引物设计平台（http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html）并上传导入EV71 VP1 gene.txt文件。

3. 无需做ParameterSet，直接点击Primer Design并进入引物设计界面。

4. 当直接点击Generate时，平台只提供了一套系统默认的LAMP引物。数量过少显然满足不了IMSA引物设计。此时，需要点击DetailSetting以获得更多套LAMP引物。

5. 点击DetailSetting后，再点击Generate，平台可提供的LAMP引物增加到25套。然而，当点击Display时，所呈现的引物实际上是同一类引物，因为F1c和B1c的位点几乎一致。

Tip 1: 利用LAMP引物平台来设计IMSA引物的重中之重就是寻找F1c和B1c位点可高度重叠（即完全互补）的不同引物组合，还要兼顾每套引物能不能设计出所需的环引物来。

6. 更改ParameterCondition中默认的Normal至AT rich。默认显示Normal说明我们所上传VP1 gene的序列中GC含量位于40%-65%的正常范围内。高于65%属于GC rich；低于40%属于AT rich。

7. 再次点击Generate时平台显示有1000或高于1000套引物生成。此时，按照Tip 1要求挑选对应引物组合。

8. 点击Display，SortingRule选择None。这时可呈现F1c和B1c位置平行迁移的引物组合。从高达1000套引物中我们可以找到很多套符合Tip 1要求的引物组合，比如第16套与第39套。它们的F1c和B1c是完全互补的。

Tip 2：我们也选择SortingRule为Dimer，这样呈现的引物组合是以引物二聚体的稳定性从低到高排列的。二聚体稳定性越低，引物性能越好。

9. 确定选择第16和39套引物组合后，我们只需要第16套引物的B1c、B2和B3位点，第39套引物的F3、F2和F1c位点作为IMSA引物位点，因为是前者的B1c和后者的F1c重叠。反过来，如果是前者的F1c和后者的B1c重叠，所选位点刚好互换。

10. 再利用每套引物设计环引物，但只取第16套引物的下游环引物LB和第39套的上游环引物LF作为IMSA引物位点。

如何设计环引物，这里以第16套引物为例：

（1）选择该套引物，点击Confirm；

（2）在接下来的页面中点击Primerinformation，系统自动下载一个文档；

（3）找到该文档，邮件选择打开方式为记事本，可得引物信息。再次点击文档，另存为Up-LF或Down-LB.txt文件。这里的第16套引物，我们需要它的下游环引物即LB，故名为Down-LB。这样命名的目的是为了防止混淆；

（4）同样打开LAMP引物设计平台（http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html）并上传导入Down-LB.txt文件；

（5）依次点击Generate和Display，即可得相应环引物。

显然，有我们要选的LB。从高到低，依次为系统默认引物性能从强到弱的环引物。

Tip 3：如果某套引物无法自动设计出对应的环引物时，有三种策略：

一是点击DetailSettings，调整引物长度至15-28试试，不要轻易动Tm和GCrate两项设置；

二是可直接选取F1c和F2之间的序列作为上游环引物，或B1c和B2之间的序列作为下游环引物，但不得有很强的自身引物二聚体结构，且Tm值需在60-66之间。这只是无奈之举；

三是重复步骤8，重新挑选引物组合，使平台能自动设计出环引物为最佳。

11. 至此，以选择第16和39套引物组合为例，我们获得了IMSA引物设计所需的七个位点，从上游至下游依次为F3、F2、LF、F1c/B1c、B2、LB、B3，其中F1c和B1c完全互补，算作同一个位点。按着IMSA引物位点组合，可得：

IMSA外引物DsF=LF+F3

IMSA外引物DsR=LB+B3

IMSA内引物FIT=F1c+F2

IMSA内引物RIT=B1c+B2

IMSA茎引物SteF=LB

IMSA茎引物SteR=LF

12. 合成所设计的IMSA引物，并通过实际实验，从特异性、灵敏度和反应时间等方面来验证该引物是否合适。经济条件允许的话，可同时合成三套或三套以上，以缩短验证周期。