十年深耘，优化ALK融合基因检测 国家癌症中心/中国医学科学院肿瘤医院病理科JTO再发文
2020年11月26日胸部肿瘤学杂志(Journal of Thoracic Oncology,2019年影响因子13.357)在线发表了由我科分子室团队针对非小细胞肺癌ALK/ROS1/RET融合基因分子病理精准检测的文章（第一作者是李卫华）。https://authors.elsevier.com/sd/article/S1556-0864(20)31023-6间变性淋巴激酶（ALK）融合作为肺癌中最常见的融合类型，在肿瘤的发生发展中起着重要作用。近年来针对它的TKI抑制剂已广泛用于晚期非小细胞肺癌的临床治疗，显著提高了ALK阳性患者的客观缓解率并延长了无进展生存期（PFS）。国家癌症中心/中国医学科学院肿瘤医院病理科应建明教授团队自2011年起即开始了对ALK融合基因分子检测的相关研究。目前，针对ALK融合检测的分子病理学方法有多种，主要包括荧光原位杂交（FISH）、免疫组化（IHC）、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和高通量测序（NGS），每种方法都有其优缺点，如何在面临不同人群、检测样本时选择最优的检测平台对ALK融合进行精准检测，以达到精准治疗的临床需求一直是我们的研究定位与追求。为此，本团队这十年来围绕ALK基因融合的分子检测优化与规范化开展了一系列的研究，包括：（1）通过与FISH和RT-PCR比对，明确了Ventana IHC检测ALK融合的可行性1，并在上千例大样本肺癌人群中做了进一步验证2，且将ALK检测的应用范围由组织样本推广到细胞学样本3；（2）利用IHC分析了ALK融合在肺癌原发灶和转移灶之间的异质性4, 5、肿瘤内的异质性6以及不同病理医生判读存在的差异7；（3）通过NGS探索了EML4-ALK融合患者接受TKI靶向治疗后PFS存在差异的原因，明确了EML4-ALK不同亚型以及TP53伴随突变对靶向治疗疗效的影响8, 9；（4）借助NGS发现了一些特殊ALK融合病例，包括FISH阴性IHC阳性的具有罕见融合伴侣的病例10, 11、基因间融合伴侣的病例等12，并联合应用其它平台对其分子特点及对靶向治疗的反应进行了深入分析。基于以上的研究，结合临床实践经验及国内外文献，我们与我院肿瘤内科王洁教授团队、北京协和医学院北京协和医院病理科梁智勇教授团队牵头，国内多家医院专家共同参与编写了《中国非小细胞肺癌ALK检测临床实践专家共识》13通过前期研究，我们发现基于DNA的杂交捕获NGS（DNA NGS）虽然可以仅使用肿瘤基因组DNA就可同时对突变、融合和扩增进行检测，但是其对融合的检测存在一些缺陷，其中一条就表现在有些DNANGS检出的ALK阳性的病例根据其DNA水平的融合断点位置推测得出的RNA水平断点与其真实的融合转录本断点并不相符，但是哪些样本会出现这种现象并不清楚。因此，我们对DNA NGS检出的经典EML4-ALK融合和罕见融合【包括非EML4-ALK融合（single non-EML4-ALK）及ALK相互融合（primary/reciprocal ALK）】进行了RNA（靶向RNA NGS和全转录组测序）和蛋白（IHC）水平的确认。结果发现经典EML4-ALK融合DNA、RNA和蛋白水平具有高度一致性，且由DNA断点推测得出的RNA断点与RNA NGS测到的断点位置相同。但是对于罕见融合，DNANGS阳性的病例中有一小部分（约10%）并没有转录翻译出融合蛋白（RNA NGS和IHC结果阴性），且此类患者靶向治疗无效；剩下的罕见融合病例虽然能够产生ALK融合转录本，但RNA NGS显示其RNA水平的融合伴侣大多为EML4基因，而不是DNANGS所检测到的罕见基因伴侣，而且所有的相互融合病例中的5‘ALK融合并没有转录翻译出融合蛋白。我们同时检测了ROS1和RET融合，亦观察到了相同的特点14。基于上述结果，本研究总结得出：（1）DNA NGS检出的ALK罕见融合存在无法转录翻译成有功能融合蛋白的可能性，如仅在DNA水平检出融合的病例往往靶向治疗无效；（2）随着NGS的广泛应用，有越来越多的ALK罕见融合伴侣被发现（报道已多达上百种Ou IS-H, Zhu VW and Nagasaka M. Catalog of 5’ fusion partners in ALK-positive NSCLC circa 2020. JTO Clinical and Research Reports. 2020; 1: 1-10.），但实际上基于DNA NGS检出的融合伴侣可能并不准确，多数病例其真正的融合伴侣（RNA水平）仍为经典的EML4基因，在真实世界中ALK的融合伴侣种类可能并不多；（3）DNA NGS检出的相互融合其5’ALK不会产生有功能的融合蛋白。因此，如果临床上仅依靠DNA NGS检出的罕见ALK融合断点来预测靶向治疗的疗效可能并不准确，对此类罕见融合联合应用RNA/蛋白水平的检测可能能够更好地指导后续的精准治疗。1. Ying J, Guo L, Qiu T, et al. Diagnostic value of a novel fully automated immunochemistry assay for detection of ALK rearrangement in primary lung adenocarcinoma. Ann Oncol. 2013; 24: 2589-2593.2. Yang L, Ling Y, Guo L, et al. Detection of ALK translocation in non-small cell lung carcinoma (NSCLC) and its clinicopathological significance using the Ventana immunohistochemical staining method: a single-center large-scale investigation of 1, 504 Chinese Han patients. Chin J Cancer Res. 2016; 28: 495-502.3. Li W, Zhang Z, Guo L, Qiu T, Ling Y, Cao J, Guo H, Zhao H, Li L, Ying J. Assessment of cytology based molecular analysis to guide targeted therapy in advanced non-small-cell lung cancer. Oncotarget. 2016;7(7):8332-40.4. Ma W, Guo L, Shan L, et al. Homogeneity and High Concordance of ALK Translocation in Primary Lung Adenocarcinoma and Paired Lymph Node Metastasis. Sci Rep. 2017; 7: 10961.5. Qiu T, Li W, Zhang F, Wang B and Ying J. Major challenges in accurate mutation detection of multifocal lung adenocarcinoma by next-generation sequencing. Cancer Biol Ther. 2020; 21: 170-177.6. Qiu T, Zhang F, Li W, Guo L and Ying J. Concurrent Presence of ALK Rearrangement and MET Mutation in Lung Adenocarcinoma. J Thorac Oncol. 2019; 14: e42-e44.7. 李琳, 张莉萍, 韩昱晨, et al. 肺腺癌ALK Ventana-D5F3免疫组织化学检测结果判读一致性质控研究. 中华病理学杂志. 2019; 48: 921-927.8. Li Y, Zhang T, Zhang J, et al. Response to crizotinib in advanced ALK-rearranged non-small cell lung cancers with different ALK-fusion variants. Lung Cancer. 2018; 118: 128-133.9. Song P, Zhang F, Li Y, et al. Concomitant TP53 mutations with response to crizotinib treatment in patients with ALK-rearranged non-small-cell lung cancer. Cancer Med. 2019; 8: 1551-1557.10. Li W, Zhang J, Guo L, et al. Combinational Analysis of FISH and Immunohistochemistry Reveals Rare Genomic Events in ALK Fusion Patterns in NSCLC that Responds to Crizotinib Treatment. J Thorac Oncol. 2017; 12: 94-101.11. Shan L, Jiang P, Xu F, et al. BIRC6-ALK, a Novel Fusion Gene in ALK Break-Apart FISH-Negative Lung Adenocarcinoma, Responds to Crizotinib. J Thorac Oncol. 2015; 10: e37-39.12. Li W, Liu Y, Li W, Chen L and Ying J. Intergenic Breakpoints Identified by DNA Sequencing Confound Targetable Kinase Fusion Detection in NSCLC. J Thorac Oncol. 2020; 15: 1223-1231.13. 中国非小细胞肺癌ALK检测模式真实世界多中心研究专家组 and 中华医学会病理学分会分子病理学组. 中国非小细胞肺癌ALK检测临床实践专家共识. 中华病理学杂志. 2019; 48: 913-920.14. Li W, Guo L, Liu Y, et al, Potentialunreliability of uncommon ALK/ROS1/RET genomic breakpoints in predicting the efficacy of targetedtherapy in NSCLC, J Thorac Oncol. 2020, doi: https://doi.org/10.1016/j.jtho.2020.10.156.
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