Nature子刊 | 基于单细胞测序揭示白血病患者间的克隆多样性及突变进化模式

越来越多的研究表明，肿瘤细胞的克隆多样性对于化疗抗性、癌症复发和预后不良有重要影响。同时，克隆多样性也可反映肿瘤内部体细胞突变的积累过程。目前，克隆多样性研究主要使用传统的高通量测序对肿瘤样本的变异等位基因（variant allele fraction）频率进行推断。但是传统测序方法检测的是大量细胞突变累积的结果，难以用来推断克隆内细胞间共同发生的突变，因而无法准确刻画克隆的结构。

近日，美国安德森癌症中心的研究团队利用单细胞测序数据探索了肿瘤细胞克隆多样性。基于测序数据，研究人员发现了倾向于同时发生的驱动突变和互斥突变，并确定了急性髓细胞性白血病（acute myeloid leukemia，AML）的演变过程。此外，通过一组纵向样本的单细胞DNA测序数据，研究进一步观察了在响应不同治疗方法时克隆结构的改变，发现单细胞测序分析可以为治疗决策提供一定的依据。该研究结果发表在Nature Communications上。

图1.文章发表在Nature Communications上。

研究团队利用Mission Bio的Tapestri单细胞测序平台，对123名AML患者的154份肿瘤细胞样本进行了单细胞测序，并进行了常规批量测序，以指导对哪种靶基因组进行单细胞测序分析。最终，研究人员一共对超过73万个细胞进行了测序，在31个癌症相关基因中发现了543个体细胞突变，并对98％的基因进行了正交验证。结果显示，最常见的突变发生在NPM1、DNMT3A和NRAS基因中。

进一步分析发现，虽然同一患者会出现许多功能冗余的突变，但这些突变通常不会同时出现在相同的克隆中。这种特定突变发生在单个克隆中的现象，在受体酪氨酸激酶（RTK）/ Ras GTPase（RAS）/ MAP激酶（MAPK）信号通路中，以及IDH1、IDH2、TET2和IDH基因中都存在。

研究人员还利用单细胞突变数据为患者重建了肿瘤进化树（phylogenetic trees），结果显示，大约一半的AML患者表现出经典的癌症发展模型——线性克隆进化，而另一半表现出分支性克隆进化。

此外，研究团队还使用Tapestri平台分析了26位患者的单细胞DNA和细胞表面蛋白，并据此分析了细胞之间的基因型与表型的相关性。发现具有NPM1或IDH突变的细胞会表达较低水平的CD34和HLA-DR，具有TP53单突变（TP53 p. V143M-mutant ）的细胞具有CD34+ CD117+表型，而TP53双突变细胞（TP53 p. V143M and p. Y220C double mutant ）则具有单核细胞免疫表型。

图2. 使用SCITE模型得到的亚克隆的免疫表型。

最后，研究人员根据15名患者的46个纵向标本研究了克隆群体结构如何响应治疗。例如，接受FLT3抑制剂阿扎胞苷（azacitidine）和索拉非尼（sorafenib）治疗的患者，检测到的亚克隆中存在与复发相关的FLT3突变，表明这部分克隆在自然选择中发生了正向突变。同样，另一名患者在用阿扎胞苷和IDH2抑制剂依那昔布（enasidenib）治疗期间，表现出对NRAS、PTPN11、FLT2-ITD和IDH1突变的克隆选择。 

图3.响应FLT3抑制剂治疗的克隆选择。

文章通讯作者、安德森癌症中心白血病系Takahashi博士表示：“虽然从利用传统高通量测序的纵向研究中也能获得类似的数据，但单细胞测序数据能够提供更精准的肿瘤内部克隆动态图谱，这不能通过传统测序方式实现。”

研究团队表示，该研究是迄今为止以单细胞分辨率表征的最大的AML患者队列，可帮助人们更深入地了解AML的基本克隆结构。该研究工作的目标之一是评估单细胞测序是否可以应用于残留病灶的监测工作。虽然单细胞测序相关的技术挑战仍然存在，但患者人数和单细胞测序深度仍使该研究中的克隆关系和系统发育得到了可靠的分析。