立即注册找回密码

QQ登录

只需一步,快速开始

微信登录

微信扫一扫,快速登录

小桔灯网

小桔灯网 门户 资讯中心 专家视角 查看内容

【专家论坛】分子诊断技术在遗传代谢性疾病中的应用及问题分析

2020-9-23| 编辑: 归去来兮| 查看: 383| 评论: 0|来源: 中华检验医学杂志 | 作者:作者:李萍 谢小兵

摘要: 文章来源:中华检验医学杂志,2020,43(07):697-701作者:李萍 谢小兵摘要遗传代谢性疾病(IMD)又称先天性代谢缺陷,从发病率来看IMD属于罕见病,虽单一病种发生率均较低,但作为一类疾病的群体患病率较高。迄今发现 ...



文章来源:中华检验医学杂志,2020,43(07):697-701

作者:李萍 谢小兵




摘要

遗传代谢性疾病(IMD)又称先天性代谢缺陷,从发病率来看IMD属于罕见病,虽单一病种发生率均较低,但作为一类疾病的群体患病率较高。迄今发现的IMD疾病有700多种,并随着分子诊断技术的提高而逐步增加。由于IMD受累基因多,临床症状复杂多样,且不具有特异性,对IMD的准确诊断存在很多困难和挑战。本文就IMD发生的分子基础、疾病诊断思路、检测手段及其在临床应用中存在的问题进行阐述。




遗传代谢性疾病(inherited metabolic disorders, IMD)又称先天性代谢缺陷(inborn errors of metabolism, IEM),是指由于基因突变引起酶、细胞膜功能异常或受体缺陷,从而导至机体生化代谢紊乱,造成中间或旁路代谢产物蓄积,或终末代谢产物缺乏,引起一系列临床症状的一组疾病[1]。IMD从发病率来看属于罕见病,虽单一病种发生率均较低,但由于病种多,IMD总体上发病较常见。目前尚缺乏完整的IMD流行病学调查,据不完全统计,英国西米德兰IMD发生率为1.28‰(1/784)[2],加拿大不列颠哥伦比亚省为0.40‰(1/2 500)[3],意大利为0.39‰(1/2 555)[4]。《中国出生缺陷防治报告(2012)》显示我国出生缺陷发生率约为5.6%。许多IMD可以通过恢复代谢紊乱途径而达到良好的治疗效果,而对IMD早期诊断是为患者制定干预和治疗方案的前提条件。

临床上通过生化和串联质谱手段检测血液或尿液中某些氨基酸、有机酸、碳水化合物、维生素等相应代谢物质含量的异常进行初筛IMD。如检测血或尿中苯丙氨酸、苯丙酮酸的含量作为新生儿苯丙酮尿症(phenylketonuria, PKU)(OMIM 261600)的筛查内容[5],检测半乳糖用于初筛半乳糖血症(galactosemia)(OMIM 230400)[6]。生化和串联质谱的临床应用以及新生儿IMD筛查工作的开展对于这一类单基因代谢性疾病有着重要的指导意义。但由于患者的遗传背景和环境因素复杂的交互作用,使得某些患者的症状表现非典型,出现症状的轻重和时间都有较大差异,容易出现漏诊和误诊,这给IMD诊断带来了挑战。

随着分子检测技术的快速发展,聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)、基因芯片以及高通量测序在临床的广泛应用,为IMD的诊断提供了新手段,不仅对已知的单基因IMD作出诊断,还能发现新的致病基因,为临床不典型症状或新发临床症状作出进一步的阐释。本文就IMD发生的分子基础、疾病诊断思路、检测手段及其在临床应用中存在的问题进行阐述。


一、IMD发生的分子基础

对IMD的研究起始于1902年一位英国医师Garrod[7]发表的专题论文,他将人类的疾病与孟德尔遗传定律联系起来。所有IMD归根到底都是由DNA突变引起的,人基因组DNA序列发生变化,即遗传变异是产生人类遗传病的根源。以单基因病为代表的IMD的产生是由于DNA分子发生了影响编码蛋白质序列的变异,且致病的突变基因可通过生殖细胞产生的配子传递给后代,使后代发生遗传病,即生殖系突变。与之相对应是发生在生殖细胞以外的突变,即体细胞突变,这类突变主要与肿瘤的发生有关。基因突变是遗传检测中主要关注的靶点,也是阐述IMD基因型和临床表型之间关系的核心。

而基因是通过蛋白质来行使功能的。人体蛋白质功能种类很多,包括酶蛋白、载体蛋白、结构蛋白、转录蛋白、核糖体蛋白及受体等,这些蛋白质功能的异常均可引起IMD,其中几乎一半以上是由于酶的活性丧失引起的[1]。酶的催化活性的丧失可引起底物累积、代谢产物缺失以及其他不利的生化反应。临床上根据IMD的发生原因和机制制定了一系列相应的筛查和治疗措施[8,9,10]

根据受累蛋白质种类将IMD分为由酶蛋白缺失和非酶蛋白变性导至的两大类疾病。酶蛋白缺失导至的IMD主要是由于底物的累积引起,少部分是由于产物的不足而致病。

在底物的累积为致病因子的IMD中,通常底物A经过酶E1的催化生成产物B,产物B可能是酶E2的底物。如果编码酶E1的基因发生突变导至酶活性丧失或下降,使底物A在体内的大量蓄积,以底物A的化学特性及受累器官而异,患者可以产生不同的病症,如缺乏苯丙氨酸-4-羟化酶(phenylalanine hydroxylase, PAH)所导至的PKU,体内蓄积的苯丙氨酸引起一系列的症状[11]

在产物不足为致病因子的IMD中,如果编码酶E2的基因发生突变导至酶活性丧失,从而使底物B的蓄积和产物C不足甚至缺乏,如丝氨酸缺失综合征(serine deficiency syndrome, SDS),是由于3-磷酸甘油酸脱氢酶或3-磷酸丝氨酸磷酸酯酶缺失导至丝氨酸产物合成不足,引起先天性小头畸形、严重的精神运动性阻滞和癫痫发作。

以上所述的受累蛋白质是酶蛋白,如果改变蛋白质功能的是其他蛋白质,如结构蛋白、转移蛋白或受体等非酶蛋白,则会引起相应蛋白质功能异常的IMD,如成骨不全症(osteogenesis imperfecta, OI)是由编码胶原蛋白的基因突变引起的遗传型骨脆症。


二、IMD的诊断思路及实验室检测手段

(一)IMD诊断思路
IMD按其发病机制和病理生理改变大致分为三类:(1)代谢途径的某些终末产物缺乏,产生的症状多为进行性、持续性改变,如过氧化酶体病、溶酶体病。(2)受累代谢途径中间和(或)旁路代谢产物大量蓄积,如苯丙酮尿症、同型半胱氨酸尿症、半乳糖血症、黄嘌呤尿症等,通常因为代谢物蓄积造成的毒性症状,其发病或早或迟,发病前常有无症状期,或症状呈间歇发作。(3)代谢途径受阻导至对肝脏、脑、肌肉等组织能量供应不足,如糖代谢障碍中的糖原贮积病,脂肪酸氧化缺陷、线粒体呼吸链功能障碍等。以上三类病理生理改变可单独出现,也可同时出现在一种疾病中,通过直接或间接影响多个器官系统,特别是脑的发育和功能,严重者可致残,甚至危及生命。因此IMD的诊断需首先在临床症状、体征、实验室检查等资料的基础上,结合家系成员的发病情况初步给出疾病方向,可能涉及哪些代谢通路障碍,这一步定义为粗略的"临床诊断";通过进一步细化后的检测项目,如,相应的糖代谢、氨基酸代谢、脂肪酸代谢、有机酸代谢等途径的关键检测指标,来初步判断是哪种代谢通路障碍,这一步定义为"生化诊断";为进一步明确具体哪种酶蛋白、受体、转运载体蛋白等的缺陷,需进行分子诊断,根据情况选择合适的分子诊断方案,如PCR、Sanger测序、高通量二代测序以及芯片技术等,这一步定义为精准的"分子诊断"。在患者或先证者身上确定了致病基因后,还需在家系成员(父母、兄弟姐妹,必要时其他成员)中进行验证,是否遵循孟德尔遗传方式,为常染色体还是性染色体,是显性还是隐性遗传等;最后明确致病基因和致病位点,从而制定出一系列普查、干预和治疗的措施。

(二)IMD的实验室检测手段
1.常规实验室检测指标:
常规实验室检测指标是筛查IMD最经济和简便的初步方法,如血糖、血氨、肝肾功能、酶学等检查。重视常规检验中出现的异常值,如通过低血糖、肝功异常(谷丙转氨酶、谷草转氨酶、胆汁酸等)筛查出X-连锁肝糖原病(X-linked hepatic glycogen storage disease)(OMIM 306000),通过肾功能指标中尿酸极低值筛查出黄嘌呤尿症,通过高血氨筛查出尿素循环代谢酶先天性缺乏导至的IMD,通过血常规中血小板降低、血涂片粒细胞出现包涵体这一现象筛查出May-hegglin综合征。常规实验室指标需结合临床以及后续进一步的"生化诊断"和"分子诊断"作出IMD诊断。

2.串联质谱、气相/液相色谱技术:
串联质谱分析技术(tandem mass spectrometry, TMS)通过识别离子特性(质量电荷比)并与标准物质比较,用来快速检测和定量分析各种代谢物,特别是针对新生儿IMD的筛查,TMS是重要的检测手段,可通过一滴血或尿液标本就可检测多种有机酸、酰基肉碱以及氨基酸等代谢物,具有所需样本量少、敏感度高、应用范围广的优点,是目前可靠、有效的检测技术[12,13],但串联质谱仪的价格与保养费用较高。高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)是一种较新的氨基酸定量分析方法,具有灵敏、快速、低价等特点,可用于疑似IDM患者尿或血浆中氨基酸检测。基于大多数有机酸的低分子量、溶解性等物理特性,通常采用气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)对尿液标本进行有机酸分析,做到定性和定量检测,是协助IDM诊断的有效方法。但是据研究报道,GC-MS检查无法确诊部分物质代谢障碍的疾病,如希特林(Citrin)蛋白缺乏症表现不典型,尿液异常代谢物并不明显,难以依靠生化指标检测确诊,因此还需依赖分子诊断技术[14,15]

3.分子诊断技术:
随着分子生物学技术的发展,分子诊断技术在人类疾病诊断发挥着重要的作用,特别是在遗传病的诊断中具有显著的优势。

基因扩增技术:临床应用最广泛的IDM分子诊断技术就是PCR及其衍生方法,如巢式PCR、多重PCR、逆转录PCR、实时荧光定量PCR、数字PCR、变性高效液相色谱分析等。大多数的基因突变检测技术都是以PCR技术为基础。很多DNA测序方法首先通过PCR技术扩增,再通过测序技术测序,最后通过特定的生物信息学软件对大量的数据进行分析。

一代测序技术:一代测序技术在IDM诊断中主要是Sanger测序。Sanger测序是最经典的测序方法,广泛应用于基因组DNA、cDNA等序列的检测。但该技术检测通量低、成本高、耗时长,不适合大规模片段测序,适用于检测点突变导至的单基因遗传病,如利用Sanger测序法在家系成员中验证已从先证者筛查出来的突变位点。

高通量测序技术:高通量测序技术即下一代测序(next generation sequencing,NGS)技术是近年来快速发展的测序技术,与一代测序技术相比,它不仅检测速度快,还能同时快速检测多个基因,为数百种罕见的遗传代谢病提供了诊断和研究方法,显著提高了诊断率。其中全外显子测序技术(whole exome sequencing, WES)在IDM诊断方面运用较广泛[16]。相比于全基因测序,WES价格低、用时短、覆盖广、准确率高、简便经济,但WES技术存在局限性,主要体现在诊断率不高以及结果解释方面。队列研究显示,WES用于诊断IMD的诊断率只有22%~41%不等[17,18,19]。对于富含胞嘧啶和鸟嘌呤的外显子存在难以测序问题,以及WES结果中存在难以解释的和临床意义不明确的变异位点和拷贝数[20]。此外,由于WES集中于外显子区域的测序,不能获得完整的基因组信息,如内含子区、增强子区、microRNA等非编码区,这些区域的致病性突变位点则会被漏检。

微阵列基因芯片技术:微阵列基因芯片简称基因芯片,是由千万个DNA或寡核苷酸探针密集排列在小面积载体表面形成的微点阵列,载体上的已知序列的探针与待测样本中的靶序列进行特异性互补结合,通过检测杂交信号实现样品DNA序列的分析[21]。该技术具有高通量、微型化、自动化程度高等优势,主要用于IMD已知致病位点的筛查。对于新发突变位点以及未知临床意义的突变位点筛查则仍需依赖测序技术。


三、分子诊断技术在IMD的应用

选取本实验室罕见病糖原累积病和黄嘌呤尿症案例进行分子诊断分析。

(一)糖原累积病(glycogen storage disease, GSD)
患儿,男,7岁,肝大、肝功能轻度受损4年余。4年前肝穿刺可见肝细胞透明变性和肝细胞糖原丰富,初步认定为GSD。自发病以来肝脏肿大,谷丙转氨酶和谷草转氨酶升高,体格发育迟缓。为进一步明确诊断需进行基因检测。因GSD受累基因种类多,疾病分型也多,为准确找到致病基因以明确GSD分型:(1)抽取患儿EDTA外周血,提取基因组DNA。(2)进行WES分析,发现位于X染色体上的PHKA2基因第32外显子上存在c.3373G>A(p.E1125K)突变,该突变已收录在人类基因突变数据库(human gene mutation database, HGMD)中。(3)经Sanger测序验证WES结果,以上位点为纯合突变。(4)利用Sanger测序在家系成员中验证突变位点,结果显示患儿母亲存在PHKA2基因c.3373G>A(p.E1125K)位点的杂合突变,父亲为正常基因型,遵循X连锁隐性遗传。PHKA2基因为磷酸化酶激酶肝脏-α亚基的编码基因,该基因c.3373G>A(p.E1125K)纯合突变所致的疾病为糖原累积症Ⅸa型,又称X-连锁肝糖原累积症(X-linked hepatic glycogen storage disease)[22]

诊断结论:糖原累积症Ⅸa型,致病基因和位点为PHKA2基因c.3373G>A(p.E1125K)。

(二)黄嘌呤尿症
患者,女,40岁,肘后部关节处无明显诱因疼痛1个月余。常规实验室检查:血尿酸为0 μmol/L(参考范围:137~363 μmol/L),血常规、肝功能、心肌酶谱等指标未见异常,近期未服用药物。多次复查血尿酸和尿尿酸,结果均为0 μmol/L,考虑为嘌呤核苷酸代谢障碍。(1)采用HPLC检测患者尿液中黄嘌呤和次黄嘌呤浓度,分别为270 μmol/mmolCrea(参考范围:<18 μmol/mmolCrea)和186 μmol/mmolCrea(参考范围:<14 μmol/mmolCrea),明显高于正常,因此考虑该患者为黄嘌呤尿症,又称低尿酸血症[23]。(2)为进一步明确致病基因和突变位点,进行WES分析,检测到XDH基因c.2737C>T(p.R913W)和SEPT9基因上c.655C>T(p.R219W)突变位点。(3)经Sanger测序验证患者WES结果,以上两个位点均为杂合突变。(4)利用Sanger测序在家系成员中验证突变位点,结果显示患者母亲存在XDH基因c.2737C>T(p.R913W)和SEPT9基因c.655C>T(p.R219W)杂合突变位点,但血尿酸正常。父亲未见异常突变位点,血尿酸正常。

外显子组整合数据库(Exome Aggregation Consortium, ExAC)显示该病例的XDH基因c.2737C>T(p.R913W)在人群中的发生频率为0.18‰,且HGMD未收录该突变。2016年Dent等[24]报道XDH基因上c.2738G>A (p.R913Q)突变与个体对药物硫嘌呤不耐受有关,该突变与本文报道的氨基酸突变位置相同,但其核苷酸突变位点以及突变后的氨基酸均不相同。SEPT9基因如果发生致病性变异可引起遗传性神经营养性肌萎缩,但目前未见SEPT9基因的c.655C>T(p.R219W)位点与黄嘌呤尿症之间关系的报道。ExAC显示SEPT9基因上c.655C>T(p.R219W)在人群中的发生频率为0.40‰。参照美国医学遗传学与基因组学学会(The American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG),本文报道的XDH基因c.2737C>T(p.R913W)位点为支持性致病性证据(PP2)。

诊断结论:黄嘌呤尿症,XDH基因c.2737C>T(p.R913W)和SEPT9基因c.655C>T(p.R219W)杂合突变可能为致病原因、存在遗传异质性,也可能存在其他未筛查到的突变类型,如基因拷贝数改变、缺失或插入突变。该病例报道见参考文献[25]。


四、分子诊断在IMD应用中存在的问题及对策

自从Garrod提出先天性代谢缺陷的概念以来,迄今发现的IMD疾病有700多种[26],并随着分子诊断技术的提高而逐步增加。由于受累基因多、临床症状不具有特异性、IMD的高度遗传异质性以及表观基因组学的效应作用[27],对IMD的准确诊断存在很多困难和挑战。

首先IMD病种多,涉及专业范围广,且发病隐匿、临床表现不特异等特点对分子诊断方案没有固定模式,针对每个患者都需要个性化诊断方案,这就对遗传病科医生和分子检测人员提出了更高的要求。我国陆国辉教授等[28]指出临床遗传基因检测诊断必须具备完整的医学遗传学专业教育培训管理系统,要实现精准遗传分子诊断需要多个不同的临床遗传分专科的参与,以及各分专科和患者为中心的密切配合,而目前遗传病的诊疗服务在我国医学教育体系中是欠缺的。其次对基因变异的准确解读至关重要,在对(罕见)遗传病的诊断服务过程中,基因检测、结果解读和遗传咨询是不可或缺的三个重要步骤。以疾病表型为主的基因检测项目和全基因组测序会越来越普及应用,为精准医疗奠定了基础,但同时如何对二代测序庞大的数据进行准确解读是最为关键的一环。只有具备准确的基因变异解读和规范的遗传咨询才能真正做到临床遗传基因精准诊断,也才有条件进行下一步的精准治疗。如病例2有临床表型,并筛出了新发突变位点,且该突变位点在暂没有表型的患者母亲身上同样存在,如何证实该新发突变与临床表型的关系需要更多临床和科研数据来支撑。

因此,在面临高精尖技术带给我们诊疗疾病高效、快捷的同时,也需要从事IMD诊断和检测的医务人员不断学习遗传病相关知识、遗传咨询、检测技术,以及加强多学科合作,提高IMD的诊疗服务水平。

参考文献(略)


声明:
1、凡本网注明“来源:小桔灯网”的所有作品,均为本网合法拥有版权或有权使用的作品,转载需联系授权。
2、凡本网注明“来源:XXX(非小桔灯网)”的作品,均转载自其它媒体,转载目的在于传递更多信息,并不代表本网赞同其观点和对其真实性负责。其版权归原作者所有,如有侵权请联系删除。
3、所有再转载者需自行获得原作者授权并注明来源。

鲜花

握手

雷人

路过

鸡蛋

最新评论

关闭

官方推荐 上一条 /3 下一条

客服中心 搜索 官方QQ群 洽谈合作
返回顶部