CRISPR技术赋能国产IVD，分子POCT可期！

借着国家鼓励研发“无需PCR实验室，操作简单的核酸检测设备”的东风，CRISPR技术又开始火了起来，这项技术最早可以追溯到三十年前，实验室生物学家实验生物学家在分析寄居于人类肠道的细菌的一个基因时，偶然发现一组重复回文密码。之后这类密码在其他细菌基因组陆续被发现。通过计算生物学家的缜密计算，判定该类密码是细菌抵制外敌入侵的关键手段。这个判定结果随后被实验生物学家在酸奶工厂得到证实。

2002年，Jansen实验室通过生物信息学分析，发现这种新型DNA序列家族只存在于细菌及古生菌中，而在真核生物及病毒中没有被发现，并将这种序列称为规律间隔成簇短回文重复序列( CRISPR)。他们将临近CRISPR locus的基因命名为cas（CRISPR-associated），并发现了4个cas基因（cas1, cas2, cas3, cas4）。目前已经发现了Cas1-Cas10等多种类型的Cas基因。Cas基因与CRISPR序列共同进化，形成了在细菌中高度保守的CRISPR/Cas系统。 

CRISPR一经发现便因其高效、便捷、适用范围广等特点，成为生命科学领域最火热的基因编辑技术，但其主要的应用场景还是集中在基因治疗、遗传性疾病、癌症靶向治疗等领域。

2015年初，有国内研究团队提出CRISPR/Cas系统在分子诊断领域将有巨大的应用前景和优势，从技术端可以追溯到加州大学（伯克利）的Jennifer Doudna博士、麻省理工张锋博士在CRISPR/Cas诊断技术方面做的发明和研究。

2017年4月张锋团队在Science期刊上发表研究成果——一个基于CRISPR/Cas13a的分子诊断技术（简称SHERLOCK）。 次年Doudna团队发现Cas12a与Cas13a具有相似的特性，并基于此发明了基于Cas12a的分子诊断技术（简称DETECTR）；国内王金团队也发表了一种基于Cas12a的分子诊断技术；周文华团队利用CRISPR系统效应蛋白Cas9在与靶核酸分子结合过程中独特的构象变化等特点，发明了针对靶核酸分子指数倍扩增的分子诊断技术（CRISDA）；2018年10月，Jennifer Doudna团队又发现Cas14a擅长识别单链DNA，可用在DETECTR诊断工具中。

纵观国内的CRISPR/Cas技术产业化发展，用于基因治疗药物研究的企业多达20余家，但将CRISPR/Cas技术用作诊断的研发企业仅有有杭州优思达、微远基因、克睿基因、杰毅生物等少数几家企业。

近期张锋教授和他的合作伙伴一起又公布了他们开发的新一代新冠病毒CRISPR检测技术的实验流程。检测过程中不需要从患者样本中纯化RNA，并且将检测新冠病毒所需的化学反应步骤在一个试管中完成。研发团队将它命名为STOP（SHERLOCK Testing in One Pot）。基于CRISPR的新冠病毒检测需要两个反应步骤，一个是恒温扩增，一个是Cas酶检测，STOP技术将其整合在了一起，其中就用到了杭州优思达（Ustar）的相关技术产品。

杭州优思达的CRISPR/Cas技术的研发储备比较早，公司高层也极为重视该项技术的研发及应用；张锋团队开发的基于CRISPR/Cas13a的分子诊断技术（SHERLOCK）采用的是恒温扩增+CRISPR/Cas技术，而优思达在恒温扩增技术领域拥有大量的研发经验，据优思达介绍其采用的也正是恒温扩增+CRISPR/Cas技术这种组合，且已拥有多项核心技术专利。

已研发成熟的产品主要是结核耐药基因检测；其选用的Cas基因为Cas12a，从目前的研究来看，该基因擅长识别双链DNA，这在鉴定一些DNA微生物时具有极大的优势。以结核分枝杆菌为例，其利福平耐药突变多发生在rpoB基因上，但这种基因突变多是随机的，称其为单核苷酸多态性（SNP）。传统的PCR手段受到荧光通道的限制，很难去全覆盖这些可能的突变。

以优思达为例，CRISPR/Cas主要由两部分组成：crRNA和Cas12a蛋白，crRNA的一段为特异性激活的RNA，另一端反向互补配对形成双链RNA结构，而特异性激活的RNA部分用于识别靶序列。 

首先Cas12a蛋白与crRNA形成一个复合体，这个复合体有一个凹槽，这个凹槽便是留给靶标DNA的反应位，然后这样一个复合体随机去撞击环境中的DNA，如果未识别到PAM序列，则会快速离开DNA，发生下一次碰撞，若识别了PAM序列，Cas12a蛋白会与特定碱基结合，形成磷酸锁结构，与PAM序列的一段发生相互作用，促使双链DNA解旋，然后利用RNA-DNA碱基互补配对原则，核对序列与crRNA的互补情况，而非特异性的切断不会激发报告因子，也就是图中的不发光，反之则发光。

从原理上来说，CRISPR分子诊断方法实际上是将扩增方法与Cas蛋白的检测相结合，在提高灵敏度的同时也提高了特异性，还降低了对仪器的依赖，优思达经过几轮的方法优化，也已经做到了多靶标、一步法检测。而优思达原来的反应管设计也为CRISPR技术创造了使用的空间，搭配全自动一体机真正的做到了分子POCT产品。

当然CRISPR技术对于单核苷酸多态性（SNP）的检测能力也为优思达的产品布局带去了很多的想象~

微远基因成立于2018年，专注于基因科技与精准医疗方向，目前拥有两大核心技术平台，包括基因编辑技术(CRISPR)的快速诊断平台与二代高通量测序(NGS)平台。产品研发方向为肿瘤靶向药物检测、动态监测、早期筛查和病原体的精准鉴定、耐药基因、毒力因子检测产品，其通过独立医学检验所或医院联合实验室的业务模式和平台，为大众提供临床检测服务。

8月27日，微远基因联合中国医学科学院病原所与多家医院单位，基于CRISPR/Cas的新冠病毒创新诊断方法CRISPR-COVID的开发研究在PLOS Pathogens杂志发表。

公司成立于2016年，是一家由CRISPR基因编辑技术应用的先驱者联合创办的转化型生物科技企业，专注于新型医药、分子诊断领域中CRISPR技术原创性应用的开发，致力于解决难治愈性肿瘤、复杂遗传性疾病的临床需求。

公司成立于2019年，是一家专注基因检测，以分子技术为平台的高新技术企业，致力于为客户提供感染性疾病分子诊断的整体解决方案。围绕基因编辑（CRISPR/Cas）和高通量测序（NGS）两大前沿技术路线，专注打造新一代分子诊断平台。

CRISPR/Cas技术在反应的过程中拥有较强的抗干扰能力，这也是为什么现在很多IVD公司看好这项技术的原因，传统的分子诊断技术大多需要进行核酸的纯化，实验的成败与核酸的纯度密切相关，如何降低样本的检测背景值是做一款好试剂的关键。

CRISPR/Cas的反应是自动进行的，对于机器温度的依赖比较少，搭配优思达的恒温扩增技术就能做到结核DNA和耐药基因突变进行检测，不管是这款产品还是微远基因的新冠检测产品，从实验结果来看都挺不错。

换个角度来看，这种技术解决了分子POCT化进程中的样本纯化难、高设备要求、高成本等问题，同时还保证了灵敏度和特异性。从行业发展来看，未来分子诊断趋于两极分化，一个走向高通量的标准流水线，另一个方向走向随时随地的床旁检测（POCT），CRISPR/Cas技术在体外诊断领域的应用或能带来一些新的思路。

参考资料：Sam的行研笔记等

Point-of-care testing for COVID-19 using SHERLOCK diagnostics.   Retrieved May 5, 2020, from

https://www.stopcovid.science/docs/STOPCovid%20Whitepaper.pdf