2019年3月华盛顿大学医学院的科学家们在nature review上发表研究综述sequencing-based methods and resources to study antimicrobial resistance，对使用NGS进行微生物耐药研究的方法和资源进行了详细的阐述。抗菌素是指抑制或杀灭细菌的小分子。这些小分子通常用于治疗细菌感染，但一些细菌在抗菌筛选压力下仍能生存、生长，即具有耐药性。耐药性出现是微生物固有属性，是微生态相生相克的自然结果。
细菌耐药性每年导至高发病率、高死亡率，悄无声息地消耗了大量的医疗资源。在美国，对一线抗菌素具有耐药性的细菌每年感染约200万人，相关费用达到200亿美元。不仅美国，欧洲微生物耐药每年导至大于3万人死亡，90万人生活质量受损。 
深入研究、了解抗菌素耐药性对于治疗耐药感染的临床实践和限制耐药传播的公共卫生努力至关重要。高通量测序技术拓展了我们对于耐药检测的能力。这篇综述从传统的抗菌素药敏试验到近年来的深度学习方法，对抗菌素耐药基因型鉴定和耐药表型预测方法进行了详细的描述。 1. 药敏实验（AST），传统培养的耐药性检测，是目前微生物科常用的方法；缺点：需要专门的微生物实验室和有经验的工作人员；只应用于可培养细菌，不能对复杂菌群样本、个别苛养菌抗性进行检测；操作时间长，流程复杂、检测通量低。2. MALDI-TOF-MS：基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱，高度依赖纯培养和数据库准确性、对待检菌的数据库涵盖程度；3. NGS ：快速，高通量，全方位，不需要培养。 1. DNA：硝基咪唑（灭滴灵；甲硝哒唑），硝基呋喃（呋喃咀啶，呋喃妥英）；2. 转录酶：利福霉素类（利福平）； 3. DNA促旋酶：喹诺酮（环丙沙星；环丙氟哌酸；悉复欢；全复康）； 4. 核酸合成：磺胺类（新诺明），甲氧苄氨嘧啶； 5. 细胞膜：脂肽（达托霉素），多粘菌素（粘菌素），吡嗪酰胺； 6. RNA合成酶：莫匹罗星； 7. 30S核糖体：氨基糖苷类（庆大霉素），四环素类（多西环素）； 8. 50S核糖体：大环内酯类（阿奇霉素），链阳菌素类（达福普汀），胺酰醇（氯霉素），林可胺类（克林霉素），恶唑烷酮（利奈唑酮），烟曲霉酸；1) 大多数耐药基因数据库缺乏有效和可持续的管理流程； 2) 许多耐药基因库命名不统一引起使用者的困惑； 3) 新出现耐药基因不能及时在数据库中更新和管理； 4) 不同耐药基因筛选流程使用不同的临界值； 5) 目前耐药基因数据库重心在可编码蛋白的抗性基因上，可能忽略了其它潜在的耐药机制。比如基因组的变化，rRNA的突变，调控元件和药物靶标的突变等。耐药基因组准确预测的关键在数据库质量。事实上，抗菌药物耐药性的注释应该是一项持续性、体系工作，建立生物技术的最佳实践方法；系统地对新发现的基因进行注释，防止误解。此外，还有哪些方法能够补充耐药基因预测呢？ 高通量测序技术及其配套的模型算法促进了耐药基因的快速鉴定和特征耐药基因组的发现；使用NGS技术不但可以同时鉴定而且可以无偏倚地鉴别培养和不可培养微生物的耐药基因特性，同时提高检测灵敏性、特异性，缩短报告时长；对人类、动物和自然环境样本进行的大规模研究，深入阐明多重耐药细菌的传播与抗菌素耐药基因的全球范围流行、分布与变迁提供了前所未有的新视角。NGS研究算法分析策略 a. 样本收集和测序流程 b. 基于拼接与直接比对的分析流程 c. 耐药基因的下游聚类、功能性分析 细菌耐药与发生机制是一个复杂的问题，需要特别注意的是，目前对于耐药基因DNA水平存在的测序证据并不能预示细菌耐药的必然性。宏转录组即所谓RNA测序，是从RNA水平对微生物基因表达与调控进行分析，拓充对细菌耐药机制的认知，建立基因型与表型的联系。转录组还能发现多基因协同作用决定的耐药表型，还能发现新现的非编码调节性RNA与耐药表型的关系。 单分子实时测序或纳米孔测序通常产出的reads长度范围在 10k ~100kb。更长的读长对与纯菌、基于宏基因组的耐药基因检测有如下几个显著的优势。 降低组装的复杂性。个案能产出细菌基因组完成图。凡事都有两面，相对于短读长测序有较高错误率(纳米孔)，目前常规应用是“长-短读长"混搭的应用方式。毫无疑问，组装得越完整，对基因组的解析就越为精准。从应用目的上，长读长测序与染色体构向捕获是一致的，利于质粒全长测序和深入研究耐药基因的水平转移。两种方法还能发现宏基因组样本中的DNA甲基化信息。此外，纳米孔测序速度优于短读长，故能更好迎合临床对快速诊断的需求。染色体构向捕获技术综合利用化学交联（cross-link）、连接酶反应及短读长测序等技术，用于解析细胞生理状态下染色体、质粒的空间关系与特征。
此类方法已用于宏基因组样本中菌群进行分析，借助对染色体空间构的分析，能更好地解释复杂的耐药基因及调控机制。更重要的是，通过耐药基因与基因组序列的关联关系，能进一步对染色体和质粒介导的耐药基因加以区分，对于耐药基因水平转移研究非常有用。将此技术应用于对宏基因组样本进行分析，降低宏基因组序列组装难度。此外，还能指导耐药基因定位注释。 抗菌素耐药性是一个重大的公共卫生威胁。监测和了解抗菌素耐药性的流行、机制和传播是病人护理和全球感染控制战略的优先事项。耐药性决定因素的准确识别以及抗菌素耐药性基因谱与抗菌素治疗结果的相关性，将有助于制定个性化的治疗方案。通过优化NGS的检测方案，随着研究发展更新系统化的耐药数据库，使用新技术，加强机器学习等有利于耐药基因的快速和准确的检测，增加临床应对耐药事件的能力。NGS在耐药基因检测上的应用和发展还将减轻抗菌素耐药性的监测工作，并使资源较少的地区能够更充分地受益于快速降低的测序成本带来的价值。 1. Carr, R. & Borenstein, E. Comparative analysis of functional metagenomic annotation and the mappability of short reads. PLOS ONE 9, e105776 (2014).2. Nurk, S., Meleshko, D., Korobeynikov, A. & Pevzner, P. A.metaSPAdes: a new versatile metagenomic assembler.Genome Res. 27, 824–834 (2017).3. World Health Organization. Global Action Plan on Antimicrobial Resistance 2015 (Report No.9789241509763) (WHO, 2015).4. Tacconelli, E. et al. Surveillance for control of antimicrobial resistance. Lancet. Infect. Dis. 18,e99–e106 (2018). | 
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