前沿文献 | 临床微生物学实验室中的mNGS：逐渐走向成熟（二）

目前，临床通常在通过涂片、培养、血清学或分子检测无法确定病因的情况才选择使用mNGS检测。换言之，只有在患者住院数周并接受昂贵的侵入性检查时，才考虑进行mNGS检测。然而，“延迟”的mNGS应用实际上在检测难治感染患者表现良好，该技术有可能成为一种快速可靠的病原体鉴定手段。

从2014年至2018年，多个病例报道证明了mNGS技术识别罕见致病原的能力，比如mNGS诊断了16岁脑炎男孩尿液中的乙型脑炎病毒、异基因造血干细胞移植患者的沙眼衣原体感染、引起原发性阿米巴脑膜脑炎的福氏耐格里阿米巴、比利时老年患者的西尼罗河病毒感染。

“新”包括新的病原体以及通过mNGS检测确定的病原体与疾病之间新的因果关系。mNGS鉴定新发病原体的相关病例，如mNGS检测出引起脑炎的玻瓦桑病毒（一种新的蜱传黄病毒）、斑点松鼠1型博尔纳病毒以及引起眼内炎的伪狂犬病病毒（可能通过与猪的污染物直接接触跨种感染人类），大大提高了人们对微生物感染的认识，提示需要新的诊断方法如mNGS，来扩大感染性疾病病原体的检测范围。

图.伪狂犬病毒引起的眼内炎患者右眼行玻璃体切除及硅油注射术后眼底照

临床上某些常见病原但常规检测难以检出。已报道的病例显示mNGS协助诊断了临床表现不典型的肝结核、免疫缺陷病人的肺孢子菌肺炎、猪带绦虫脑膜脑炎、以及神经布鲁氏菌病。

mNGS另一个优点为可以在一次检测中同时检测多种病原体。免疫抑制患者更有可能成为mNGS的最大受益者，因为该人群经常发生混合感染，且需要联合治疗。联合治疗是对抗混合感染的常见策略，但必须在整个治疗过程中对患者进行监控，以识别可能的再激活和后续治疗需求，并及早发现耐药性。随着mNGS技术越来越多地应用于临床，深入了解病原体的致病特性，以上问题可能得到解答。

临床上，在疾病评估中确认感染和排除感染同样重要。理论上，考虑到“泛病原体检测”的特性（即同时检测DNA和RNA病毒、细菌、真菌和寄生虫的能力），与有倾向性的普通检测相比，mNGS在排除感染方面似乎更有说服力。许多研究表明，mNGS的诊断性能（包括阴性预测值）优于常规方法。随着mNGS工作流程的进一步优化和临床诊断检测准确性的提高，该技术将在排除感染方面将发挥更大的作用。

及时有效的药物治疗是抗感染的关键。传统的抗生素敏感性试验（AST）或抗生素耐药基因（ARG）检测通常是针对分离培养的病原体进行的，这些方法非常耗时，同时无法获得不可培养的细菌的药敏结果。mNGS可对病原体基因组（部分或全长）进行测序，因此它对整个细菌群落中的鉴定ARGs具有极大的应用前景。

目前以三代测序为代表的实时宏基因组学似乎在检测已知ARGs的存在与否方面更具优势，长读长序列可以形成完整的微生物基因组或质粒，进而给出耐药基因的位置，区别质粒携带的耐药基因或染色体的耐药基因。且实时的宏基因组测序能够在4到6小时检出耐药基因。但该技术目前的主要缺点是测序碱基错误率，估计高达10-15%。虽然在基因组组装过程中，这些错误可以通过足够的测序覆盖率得到纠正，但将大大增加测序成本。而当前应用广泛应用的短读长测序技术不能区分耐药基因来源于质粒或染色体，甚至检测不出。

耐药基因数据库的质量和完整性对宏基因组测序识别耐药基因起着至关重要的作用。一些数据库，如CARD，ARDB，以及最近的DeepARG等已开发，但这些数据库在临床诊断中有一定的局限性，尚不能达到临床预期用途。此外，还需要开发标准化算法，以便准确地将耐药基因序列比对到检测到的病原体或背景污染物。

mNGS也有助于对病原体进行进化追踪、菌株分型和毒力预测，甚至有助于监测疾病进展和治疗效果。

在目前的临床实践中，大多数情况下，只有在常规检测失败时才考虑使用mNGS。mNGS是一项正在积极发展的技术，虽然受到许多因素（例如成本、时间、方法标准化、数据分析工具等）的影响，但随着进一步的努力，这种新方法将在更多的诊断实验室中被接受，促进该技术的日常应用是关键。

参考文献：

Dongsheng Han, Ziyang Li, Rui Li, Ping Tan, Rui Zhang & Jinming Li (2019): mNGS in clinical microbiology laboratories: on the road to maturity, Critical Reviews in Microbiology.

DOI: 10.1080/1040841X.2019.1681933