近十几年IVD行业在国内发展迅猛，笔者水木木有幸刚毕业就进入了IVD这个高速发展的行业，在POCT产品开发领域摸爬滚打多年，今天跟大家分享一下胶体金试纸条的开发过程，本来取名叫胶体金检测试纸条开发干货，写完发现自己才短思涩还达不到干货这个高度，仅仅只是对自身多年工作的一个小结，供刚入这行的同行们参考，一家之言，如果不妥之处请批评指正。
1 物料选择及处理 物料是试纸条的硬件，物料的选择和处理直接影响产品性能，下面从底片材、NC膜、样品垫、标记垫、吸收垫来逐一讲解。 底片材 底片材也叫背衬，主要是承载和黏合其它物料，也有些试纸条没有底片材，只要能将其它物料组合在一起就OK。底片材的选择要求不高，只要别粘性不好导至玻纤脱落或者太薄加烘后变形就好，国内市场上基本能满足所以尺寸要求，实在不行就定制。 有一个需要注意的点，对于无背衬的NC膜，在做加速稳定的实验时，底片材的胶有可能会渗入NC膜，导至C/T线出现一条很明显的黑线，解决办法是更换有背衬的NC膜或者更换原料点膜缓冲液。 NC膜 NC膜是整个胶体金试纸条免疫反应的载体，目前市场基本上被德国Sartorius、美国Millipore 和印度MDI三家占领，其中Sartorius应该是最常用的，主要包括CN180、CN150、CN140、CN140Unbacked、CN110、CN95六种型号，数字越大膜孔径越小，流速越慢，Millipore有HF180、HF135、HF120和MdI有15u、10u，具体参数大家可参阅相关COA。个人感觉Millipore性能综合最佳，但是价格相对贵一些，供应不太稳定，可选择用于一些流感、心肌等利润较高的产品；Sartorius的CN140较为常用，项目前期可直接先用它来初筛原料，MdI 15u的背景很干净，可用于一些传染病或者早孕产品。国内的基本上没用过，这里不作评论。 原料在包被到NC膜上之前需要稀释到合适的浓度，包被的稀释液相对来说较为简单一些，PB或者PBS缓冲液最为常用，这两者的缓冲体系对包被的抗原抗体都有较好的适应性，当然为解决某些特殊异常还会添加一些化学试剂，如添加海藻糖和蔗糖是为了保持良好的稳定性、TWEEN 20和EDTA是为了减轻部分反白现象、BSA和Casein作为封闭剂对膜进行封闭等。早期有些产品需要在包被T线的NC膜位置先划一条封闭液进行封闭，现在的产品应该比较少了。 样品垫 样品垫能分离过滤样品中的杂质，对样品进行前处理，平衡待测试样品的PH和调整盐离子强度，使样品在层析过程中保持一定的均一性和可控性。样品垫的材料主要选择玻纤、无纺布和滤纸，其中以Ahlstrom的8964玻纤较为常用。 样品垫一般需要经过前期处理才能使用，处理液一般包含缓冲液、表面活性剂和其它生物原料。根据产品使用的样本类型选择合适的缓冲液，缓冲液主要包括Tris、硼砂和磷酸盐缓冲液，尿液样本硼砂缓冲液用的多一些，血液样本Tris和磷酸盐缓冲液用的多一些。表面活性剂用的较多的包括TWEEN 20、TRITON X-100、Tetronic 1307等，建议优先选择非离子表面活性剂。其它生物原料的加入是为了解决跑板过程中出现的异常，如加入聚乙烯吡咯烷酮增加亲水性，BSA、异嗜性抗体和酪蛋白可以特异性吸附杂蛋白，降低可能出现的假阳性，EDTA可以减少轨线和消除部分反白作用等。处理液还需要加入防腐剂叠氮钠或Proclin-300，最后调节一个最合适的PH然后处理在玻纤上，烘干即可。 标记垫 标记垫是胶体金颗粒附着的载体，有些试纸条没有标记垫，将标记物直接点在样品垫上或者NC膜上也能满足要求，从精益的角度，少一种物料能省下很大量生产成本。具备非特异性吸附力低、标记物复溶和释放力好的材料可用于标记垫，目前市场上标记垫主要用的材料是聚酯膜、玻纤和无纺布，其中芬兰Ahlstrom的6613聚酯膜较为常用，项目前期可直接先用它来初筛原料。与样品垫一样，标记垫在喷点金标之前一般也需要进行前处理，处理液与上述相似，可根据具体项目配置合适的处理液。 吸收垫 吸收垫基本上都是选用滤纸，选择要求不高，有良好的亲水性和保水性即可。
2 原料标记 原料标记是胶体金试纸条最具有技术含量的环节，也是最为复杂、变数最大的环节，要讲清楚这个步骤这点篇幅是完全不够的，接下来从原料选择、金水制备、胶体金标记各方面来简单谈谈这一环节，最后再介绍一下乳胶标记。 原料选择 抗原抗体原料是胶体金试纸条反应的核心，原料没选好其它都白搭。目前市场性能好的原料大部分还是以进口为主，芬兰的Medix和HyTest、美国的Merdian、Biospacific和Abnova等，国内菲鹏做的也很不错。不过每个公司都有各自的优势产品，大家根据自己的项目选择合适自己的即可，很多公司会有试用装，工作量接受的话可以把市面上有的原料都买回来试试。因原料的价格昂贵，而且原料的更换牵涉到产品注册变更，费时费力，现在很多试纸条厂家开始自己研发原料，既省成本还能保证原料供应需求。 金水制备 胶体金是氯金酸与还原剂（如柠檬酸钠）反应形成带负电的疏水胶体溶液，反应过程颜色变化是浅黄色-透明-黑紫色-紫红色，控制氯金酸与还原剂的比例可以得到不同粒径的胶体金溶液，具体比例大家可在网上参照相关数据，通过肉眼观察溶液颜色可粗略估计颗粒的大小。标记抗体原料选用40nm的粒径较多，抗原和小分子蛋白选用20nm较多，当然也可以使用更大粒径的颗粒，大颗粒灵敏度会相对好一些，不过特异性就很难保证了。 胶体金标记 胶体金标记是蛋白质结合到胶体金上的过程，金颗粒是一种特别娇贵且有洁癖的微球，标记过程使用的器皿一定要保证足够干净。 标记过程主要包括：1. 选择合适的PH体系，胶体金颗粒与蛋白原料结合；2. 加入封闭剂对胶体金表面未与特异性蛋白结合的位点进行封闭；3. 高速离心浓缩胶体金溶液，最终的溶液OD值控制在130上下；4.最后去上清，加入适量保存液保持即可。 标记前一定要确定最佳的PH体系，一般选择在略高于蛋白质PI，PH不合适很容易导至死金。蛋白原料的加入需要提前稀释，高浓度的原料直接加入胶体金溶液也很容易死金，也可以尝试反过来加，将胶体金溶液加入到原料中。针对某些重组抗原难标记，可以使用抗体搭桥标记，先标记一个重组抗原的标签抗体，然后再与重组抗原结合。 乳胶标记 乳胶产品与胶体金产品除了标记物有区别外，其它基本上一致，所以这里顺便把乳胶标记也一起简单介绍一下。乳胶颗粒的供应商主要有Agilent、Merck、Bangs、Thermo和旭化成，综合评估旭化成的颗粒应该是最好的，不过也是最贵的。乳胶颗粒包括物理吸附和化学偶联颗粒，目前化学偶联颗粒用的比较多，偶联过程分使用EDC活化的一步法和使用EDC+NHS活化的两步法。整个偶联过程比较简单，按照说明书的步骤即可，当然针对不同原料需要选择不同粒径的颗粒和使用不用的封闭剂以及反应体系Buffer和PH。
3 试剂条结构 市场上常用的试剂条结构是样品垫+标记垫+NC膜+吸收垫，随着技术发展，为了满足某些产品的特殊要求，试剂条结构也出现了一些微调，主要包括无标记垫结构、双标记垫结构、桥垫结构和金标垫反粘结构等。 无标记垫结构 上述在标记垫那一节有说到这种结构，将标记物处理在NC膜上或者样品垫上就可以省去标记垫。处理在NC膜上胶体金可能比较少，乳胶会多一些，使用这种结构灵敏度会弱一些，标记物释放没有那么完全，建议对灵敏度要求不是特别高的或者灵敏度已经满足要求的可以尝试一下。 双标记垫结构 这种结构常见于多对原料产品，比如HIV和Flu A&B，HIV包括Ⅰ型Ⅱ型和O型，因涉及到多种亚型，使用的原料比较多，全部处理在同一标记垫上可能相互会产品影响，影响产品性能，这时候可以选择双标记垫结构。有些产品因标记物释放的影响，双标记垫结构一般比用相同使用量的单标记垫灵敏度会高一些。不过这种结构会对后期生产增加难度，处理不当标记垫容易脱落，建议大家综合评估之后再做选择。 桥垫结构 桥垫结构是在样品垫与标记垫之间加一段连接垫，对于样品垫投放了反应原料的产品，桥垫可以使样本与样品垫上的原料反应更加充分，提升产品性能，对于样品垫未投放反应原料的产品，桥垫可以减缓样本流速，有助提高产品灵敏度。桥垫的材料与样品垫一样，主要是滤纸、玻纤和无纺布，也可以尝试一下聚酯膜，桥垫也需要使用处理液进行处理。日本Determine HBsAg检测试纸条就是这种结构，这款产品是目前我见过性能做得最佳的乳胶试纸条产品，不管是特异性还是灵敏度都值得我们学习，不过它好像不在中国上市。 金标垫反粘结构 金标垫反粘是将喷金的那一面朝下粘在底片材上，这种结构比较少见，结构的目的是为了降低金标的释放速度，提高某些产品性能。
胶体金试纸条自90年代用于检测人绒毛膜促性腺激素（HCG）以来，到现在检测范围已扩展到传染病、毒品、流感、心肌、肿瘤标志物、食品等多方领域，短短30多年已经发展成最为成熟、快速、简单的体外诊断技术之一。 一根看似简简单单的试纸条，一个在10平米小型实验室就能开发的诊断产品，却养活了数家百亿市值上市公司！ 随着新IVD检测技术的发展，尤其近几年化学发光、免疫荧光的迅猛发展，有人担心胶体金会逐渐退出市场舞台，其实我倒觉得没有必要有这种忧虑，每种技术都有自己的市场定位。 胶体金试纸条的简单、快捷、方便等优点几乎很难被其它技术代替，假想一下，在一个偏远的小山村，一警察抓住一个吸毒者，吸毒者非得说自己没有吸毒，警察掏出试纸条，检测了他的尿液，5分钟后就能跟他说吸的是冰毒、可卡因还是吗啡，这种技术是不是也很赞。 |
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