立即注册找回密码

QQ登录

只需一步,快速开始

微信登录

微信扫一扫,快速登录

手机动态码快速登录

手机号快速注册登录

搜索
小桔灯网 门户 资讯中心 技术杂谈 查看内容

核酸定量内标与外标,你知道多少?

2020-6-30 00:12| 编辑: 小桔灯网| 查看: 6378| 评论: 0|来源: 分子E讯

摘要: 众所周知,在实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)中模板的浓度对数值与结果Ct值呈线性关系,Ct值越小,浓度越高。根据所选取定量数学模型的差别,主要有外标定量法(外标法)和内标定量法(内标法)两种 ...

众所周知,在实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)中模板的浓度对数值与结果Ct值呈线性关系,Ct值越小,浓度越高。根据所选取定量数学模型的差别,主要有外标定量法(外标法)内标定量法(内标法)两种定量方法。这些数学模型就像特殊标记的尺子,把得到的Ct值测量为浓度值。


外标法即绝对定量,是使用一系列稀释的已知浓度标准品与临床标本同时进行测定,求出标准品的Ct值与起始模板浓度之间的线性比例关系。通过待测标本的Ct值就可以在线性关系中求出其原始的模板浓度。


内标法:是指将标准内标与待测样本在同一管内扩增,然后通过内标的量来推导待测模板的量,是一种相对定量的数学模型。该模型是假定了临床样本和内标有一致的扩增效率。[1]


Q
A
&

内标法需要检测标准品吗?


需要。要实现对样本的定量检测,必然需要使用到已知浓度的标准品,就像天平称量离不开砝码一样。内标法就像是用了一个苹果充当砝码,但这个苹果最初肯定得使用砝码称量一遍。


与外标法直接比较待测样本和标准品不一样,内标法使用靶基因Ct值和内标Ct值的差值进行运算。多一个维度的参数,使得该方法更为准确,但也使得运算更为复杂。该差值与靶基因起始模板量之间呈二次函数关系,所以需要测定更多的标准品(6个以上)才能保证这个二次函数的准确性。


因此,内标法不但需要检测标准品,而且还需要检测更多的标准品。


Q
A
&

如何不带标准品使用内标法?


不带标准品的内标法=调用标准曲线的外标法;由于成本的考虑,使用内标法的厂家大都未使用标准品。所以在检测过程中,这些厂家便采用调取出厂标准曲线函数的方式。部分实验室在使用外标法时也会用到这个方法,但这种方式往往是极不被推荐的。因为如果不能排除不同仪器、不同批试剂、不同实验环境(温度湿度)、不同实验操作等因素造成的影响,那么结果的准确性就很难得到保证。


因而,无论是内标法还是外标法,如希望不带标准品进行检测,应尽量避免上述风险,所以只能选择全封闭系统,并对使用环境做较为严苛的要求。


Q
A
&

内标法可以彻底解决样本间差异对定量结果的影响么?


不能。不同的标本存在个体化差异,除靶序列的变异外,对PCR定量结果存在影响的还有多种因素。面对不同的干扰因素,两种方法各有优劣。

注:“-”没有影响;“+”有一定影响;“++”有较大影响;


小结

内标法和外标法作为两种不同的PCR定量方法模型,有各自的特点,并无本质的优劣势之分。作为一项检测技术,以提供科学、客观、准确的检测结果为目的,为临床医生诊断和治疗提供参考价值,充分体现检测的临床意义才是最重要的。



参考文献:
[1]李金明.《实时荧光PCR》[M].2版).科学出版社,2016年:83-93.

注:图片源于网络 侵删

声明:
1、凡本网注明“来源:小桔灯网”的所有作品,均为本网合法拥有版权或有权使用的作品,转载需联系授权。
2、凡本网注明“来源:XXX(非小桔灯网)”的作品,均转载自其它媒体,转载目的在于传递更多信息,并不代表本网赞同其观点和对其真实性负责。其版权归原作者所有,如有侵权请联系删除。
3、所有再转载者需自行获得原作者授权并注明来源。

鲜花

握手

雷人

路过

鸡蛋

最新评论

关闭

官方推荐 上一条 /3 下一条

客服中心 搜索 官方QQ群 洽谈合作
返回顶部