二代测序（Next Generation Sequencing, NGS）是一个强大的功能平台，它可以同时给数以万计的DNA分子进行测序。由于这种可以多个样本同时测序的能力，在个性化医疗、遗传疾病和临床诊断等方面，二代测序也就是高通量测序开创了革命性的领域。但是，对于癌症分子诊断、治疗和监测等需要检测低频基因变异的领域，二代测序错误是一种可能影响变异检测结果的关键混杂因素。 我们常用的体细胞突变（somatic mutation）检测软件包括：mutect2、strelka、varscan等。那么对于突变检测，我们还有哪些要注意呢？ 一个典型的NGS工作流程包含多个步骤，包括样品处理、DNA提取、PCR扩增、上机测序。这些步骤中的每一步都可能引入错误。例如，样品处理过程中的DNA损伤可引起C>A/G>T错误，DNA提取或片段化过程中甲基化胞嘧啶自发脱氨成尿嘧啶可引起C>T/G>T错误，另外，目标富集PCR及测序步骤也会引入一些错误。 在体细胞突变检测中，你是否会注意一些异常现象，偶尔会发现一些突变被质控掉了，但这是个例吗？回顾数据会发现，咦？好像同批次个别样本也会有这个突变？例如序列CAGCCGCATCCACCGGTAGCTCTTCTTCTTCTTGCGCT，红色是deletion区域。当然，这个突变被质控掉了，变异检测软件标记的str_contraction。但你是否有看数据的习惯呢？仔细观察突变附近的基因组序列发现该缺失有四个重复单元，是短串联重复区域(STR区域)的特征，这与注释也相符。我们知道，STR检测一般会有滑脱现象，等位基因数值越大（重复的单元数越多）滑脱越多，而等位基因数小的理论上滑脱的可能性很低。 表1 异常体细胞突变示例 
并且对于不同的基因组版本都存在这个现象。另外，由于该突变在同一批数据的多个样本中发现，突变频率较低。到底是捕获探针（原材料）的问题呢？还是STR区域的问题？还是NGS手段的问题？重新设计多重PCR引物，对样本进行检测发现与捕获探针一致，对NGS各个平台、公司的数据回溯分析，包括肿瘤样本和正常样本，发现超过20%的数据（正常对照）包含这个位点，而且频率都比较低（1%上下浮动）。 表2 不同公司不同产品不同测序平台分析 
因此判定这个位点是NGS系统性的误差。那就要考虑基因STR区域本身的特点造成的，STR到底是个什么东东呢，为什么会有这种诡异的影响？让我们来解开它神秘的面纱。短串联重复序列(Short tandem repeats, STR)，又称微卫星DNA(Microsatellite DNA)，通常是基因组中由1~6个碱基单元组成的一段DNA重复序列，是广泛存在于真核生物基因组中的核苷酸重复序列。由于重复单位及重复次数不同，构成了STR基因座的遗传多态性。每个STR由结构包括：具有短重复单元的核心区、核心区两侧保守的侧翼区。 
图1 STR结构示意图
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图2 微卫星的滑链错配突变模型 目前主要认为滑链错配是短串联重复序列突变的主要机制。
在DNA复制合成的过程中，新生链和模板链之间在微卫星重复区域可能发生错配，使得一个或者几个重复单位形成环状，未能参与配对。如果未配对的重复单位位于新生链，则最终得到的新生链未配对重复单位数目比模板链多。反之，如果未配对的重复单位位于模板链，则最终得到的新生链未配对重复单位数目比模板链少。有丝分裂过程中DNA链之间的错配引起的复制滑动被认为是导至STR产生的较为常见原因，并且依据不同复制单元大小的不同以及不同物种之间，复制滑动发生的概率也不相同。滑移率与STR的表观突变率不同。体外实验表明，DNA滑移率非常高。但在体内，大部分DNA环被错配重配对系统识别和消除。结果表明，功能性错配修复系统可使STR突变率降低100～1000倍。因此，观察到的STR突变率取决于滑移率和修复系统纠正不匹配的效率。常用的STR基因座突变率在0.1%～0.5%。我们再来分析上面案例，是GATK等变异检测软件中对变异的一种过滤注释，在GATK中称为hard filter，clustered_events的意思是多个变异近距离聚集出现的现象，一般来说clustered_events是一种不真实变异信号。比如可能是同源序列引起的假突变。图3 CNV引起的clustered_events
体细胞检测我们通常会采用配对样本分析，但对于这种假突变，正常对照并不一定能完全测到这些位点，因此很多背景是无法去除点的，这时，构建一组正常样本库（Panel of Normals，PON）对突变进行过滤，就显得很重要了。如果某个突变在这一组正常样本中以一定的较高频率出现，就认为这个突变为系统错误引起的，可以进行过滤，例如下图中所有位点均为case-control方式检测出的位点，底色为白色的行表示真实位点，其余位点均为非真实位点，没有被case-control方式过滤掉，蓝色表示可以被PON库过滤掉的位点。
图4 PON库比control多过滤掉的假突变示例
再回到clustered_events这块，如上面图3中的突变真实并不存在，数据库中没有记录，有可能是基因组上相似区域的序列同时比对到同一位置产生，被标记为clustered_events，可以按照指标被过滤掉；而下面图5中的突变是真实存在的，在COSMIC数据库中有记录，虽然标记为clustered_events，但是被默认指标过滤掉。
图5 MNP识别成clustered_events回到这个位点，我们再看下clinvar、dbsnp、cosmic都有记录。对于胚系突变，clinvar中有记录但结论冲突，ExAC等数据库也有但非常罕见，dbsnp中每个记录都没有验证信息，也并没有allele balance信息。对于体细胞突变，cosmic中有但信息也不多。这个位点是否值得怀疑？当然，并不排除真的有样本是存在这个突变，大家可以探讨。如果按照默认的软件指标对变异进行过滤可能会造成假阳或假阴，也就是造成检测错误，而且错误还可能来源于基因组组装错误（干试验+湿实验）。所以软件质控并不是万用的，对于体细胞突变检测，即使是配对样本，我们也需要PON，而对于假阴性，我们同样需要累积（包括cosmic公共数据库使用和内部积累），平台的数据累积才是最合适的质控。临检的分析虽没有动植物科研的多样化手段和各种美图显得复杂，但是我们对准确度的要求非常高，开展检测一定要慎重。
Ma X, Shao Y, Tian L, et al. Analysis of error profiles in deep next-generation sequencing data[J]. Genome biology, 2019, 20(1): 50.Temple-Smolkin R L, Voelkerding K V, Nikiforova M N. Guidelines for Validation of Next-Generation SequencingeBased Oncology Panels[J]. 2017.
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