临床宏基因组学技术在感染领域应用中的是与非

①mNGS应用领域广泛，目前主要集中在脑炎/脑膜炎 、呼吸道感染及血流感染，适用于常规检测失败或治疗不理想的疑似感染病例 、重症感染、免疫力低下感染等。众多临床应用研究报道显示mNGS显著提高了感染病原的检出率，尤其对于特殊/罕见/难培养/混合感染病原的检测具有明显优势。

②mNGS技术是直接从临床样本中随机抽取一定比例的核酸片段（包括大量人源宿主核酸和少量微生物核酸）进行测序、比对进而对病原进行鉴定。

不同类型的临床样本，由于人源基因组含量不同（比如脑脊液人源细胞含量较低，血标本人源细胞含量很高），对于相同病原微生物的感染，测序数据量需要不同。如果均用同样数据量，会带来不同标本类型的灵敏度差异较大（拿黑暗中开灯找钥匙进行比喻，如下图），需要差异化的临床宏基因组学产品才能使不同标本类型均具有良好的检测敏感性，真正满足临床的感染诊断需求。

①当前基于NGS平台可以较好的实现耐药基因检测的技术主要为：

a.全基因组测序

（ Whole Genome Sequencing，WGS ）：

宏基因组学分析与全基因组测序的主要区别为宿主背景的差异。通常用于病原分型、溯源、毒力及耐药分析主要针对的是纯培养物（宿主背景为0），应用的是全基因组测序。

b.靶向扩增测序

（Targeted amplicon sequencing）:

比如美国FDA于2019年11月5日批准的基于NGS的HIV耐药突变检测产品。

②由于耐药基因和毒力分析需要极高的数据量覆盖，目前还不能实现，除非结合靶向基因的测序。当前临床宏基因组测序基于经济和时间成本考虑，基本的数据覆盖在10M-20M之间，绝大多数情况下并不能有效的检测到耐药基因，仅有极少数含菌量很高的样本才能检测到，这样会导至大量的假阴性。

①在检测流程中使用共提取试剂对样本中的DNA和RNA同时进行提取，再经过额外处理后转变成DNA，将全部DNA进行二代测序文库构建，即可以实现同时对DNA和RNA病原体的共检测，但临床测试显示共检测效率只能达到各自单独检测合计总检出率的80%左右。

②不同的前处理条件对不同病原体的核酸提取效率影响不同，真菌需通过物理或化学处理提高细胞壁的裂解，以增加检出，但这些操作可能导至RNA降解，影响RNA病毒的检出，所以需要分别进行处理再合并文库构建和上机测序。

同时进行DNA+RNA合并检测，总数据覆盖应为单一检测流程的两倍，才能维持相同的灵敏度，反之检测敏感度会降低。考虑经济成本，可以结合特定RNA病毒PCR检测，对mNGS检测进行补充。

①科学研究中，通常会依据研究目不同，根据不同微生物类别来适当处理临床样本，去除部分人源核酸，达到反向富集病原微生物的效果，从而提高宏基因组技术的检测敏感性。但临床应用时，受限于报告时间和经济成本的因素，目前对临床样本按照下述方法分门别类的进行存在较大局限性。

②mNGS技术从临床样本总核酸中随机抽取一定比例的核酸片段进行测序，抽取的核酸比例越高，病原微生物被测到的概率就越高，理论上对提取的总核酸全部抽取核酸进行测试时，病原微生物就一定能被测到。通俗地拿池塘里捕鱼进行比喻，当池塘排水越干净，能捕到鱼的种类及数量就越多。因此在当前可控的测序成本情况下通过提高测序数据覆盖，可以更为经济有效的提高宏基因组检测敏感性。

比如当测序数据覆盖由20M reads提高到100M reads 时，mNGS对脓毒血症病原学检测明显改善。