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单细胞测序技术应用和发展现状研究

2019-11-11| 编辑: 面气灵| 查看: 1005| 评论: 0|来源: 火石创造

摘要: 单细胞测序( Single-Cell Sequencing) 即从单个细胞水平上对基因组进行测序,把基因测序应用到单个细胞层面,对于识别细胞的类型、功能,特定细胞健康或状态的变化、变异至关重要,已广泛应用于神经生物学,种系传播 ...




单细胞测序( Single-Cell Sequencing) 即从单个细胞水平上对基因组进行测序,把基因测序应用到单个细胞层面,对于识别细胞的类型、功能,特定细胞健康或状态的变化、变异至关重要,已广泛应用于神经生物学,种系传播,器官生长,癌症生物学等多个领域。
 

背景概况


单细胞测序技术是指能够在单个细胞的水平上,对基因组或转录组进行高通量测序分析的一项新技术。与传统高通量测序相比,单细胞测序不仅能够分析相同表型细胞的异质性,还能获取难以培养微生物的遗传信息以及珍贵的临床样本的信息,具有广阔的应用前景。


细胞是生命的单位,目前大部分的基因检测均是从组织中抽提DNA 来进行测序,得到的实验结果往往是细胞群体中信号表达的均值,是对细胞群体进行整体表征,或者只代表其中在数量上占优势的细胞信息,单个细胞独有的细胞特性往往被忽略。

而大量研究发现在同一器官或组织的相同类型细胞也表现出显着的异质性,每个细胞都有其独特的表达模式。例如实体瘤样本的总RNA,一半以上来源于非癌细胞(成纤维细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等),使得癌细胞的信号可能被隐藏。因此,采用均值对单个细胞进行表征是不合适的,可能会丢失许多关键信息。

另一方面,传统高通量测序方法,难以应用在对自然界中难培养的微生物的研究、罕见循环肿瘤细胞的转录组分析、胚胎发生最早期的分化特征研究、肿瘤的非均质性和微进化研究等精确程度较高的研究领域[1]随着细胞分选和测序技术进步,单细胞测序技术应运而生。

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(一)单细胞测序技术颇受关注

《Nature Methods》杂志将单细胞研究方法列为未来几年最值得关注的技术领域之一。《Science》杂志将单细胞测序列为年度最值得关注的六大领域榜首。

图1  2008—2018年Pubmed中单细胞测序技术文献数量变化

数据来源:Pubmed,火石创造


(二)单细胞测序技术流程

1. 单细胞分离

针对单个细胞研究时,首先将单个细胞进行分离,并确保其生物完整性不被破坏。目前常用的单细胞分离方法有连续稀释法、显微操作法、激光捕获显微切割术、拉曼镊子技术、荧光激活细胞分选术和微流控技术等。

2. 细胞溶解与基因组获取

对细胞进行溶解来获取基因组(DNA或RNA),这步骤非常关键,应尽量保证基因组的完整性。目前细胞溶解的方法可以分为3大类: 物理法、化学法和生物酶降解法。

3. 全基因组扩增

由于单个细胞中的基因含量无法达到测序仪的检测线,因此需要对基因组进行扩增,目前方法都是利用 DNA 聚合酶和不同形式的引物来进行扩增的,包括特异性的、简并的或杂合的引物。

4.测序与数据分析

对单个细胞进行测序,并对所得的数据结果进行分析。


图2  单细胞测序技术实验流程
 

单细胞测序技术应用现状


单细胞测序技术能够快速确定成千上万个细胞的精确基因表达模式,分析相同表型细胞的遗传信息异质性。目前已应用于神经生物学、器官生长、癌症生物学、临床诊断、免疫学、微生物学、胚胎学、产前基因诊断等多个领域。


图3  单细胞测序技术应用领域
 
1. 癌症研究

细胞异质性是肿瘤的重要特征。基因型异质性是指同一肿瘤内部存在具有不同基因型的肿瘤细胞,而表型异质性是指同一肿瘤内部存在具有不同基因表达谱和功能特征的肿瘤细胞。

众多科研工作者基于单细胞测序技术对肿瘤异质性进行研究,鉴定癌变细胞及癌症发展的过程XU等[3]对肾肿瘤进行单细胞测序,发现肾肿瘤细胞之间的突变频率和位置不尽相同,每个细胞的突变状态和转录情况也均不相同,表明肾肿瘤更加具有异质性,需要开发更加有效的细胞靶向疗法。

2. 发育研究


哺乳动物早期胚胎发育阶段的细胞数量极为稀少,其转录组分析尤其需要单细胞 RNA-Seq 技术。

ZHONG等[4]给予2300个妊娠胚胎人脑前额叶细胞绘制出人脑前额叶胚胎发育转录组图谱,发现在发育过程中,神经干细胞、兴奋性神经元细胞、抑制性神经元细胞以及星型胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞等六大类细胞占主导地位,揭示了神经元产生和环路形成的分子调控机制。

组织器官发育是单细胞 RNA-Seq 技术应用的另一个重要领域。近年来陆续报道了多种组织器官(包括肺、脑、肾、血液和内耳)发育过程。

3. 微生物研究

由于微生物中的基因含量较低以及样本稀少等原因,传统的测序方法无法对难以培养的微生物进行测序。基于精确程度较高,单细胞测序技术能够对单个微生物细胞进行测序,进而发现新的微生物,加深对微生物生命活动过程的认知。SUZANNE等[5]对某个稀有海洋微生物进行了测序,通过分析表明该微生物与硫氧化有关,进而发现了参与有氧代谢有关的基因。

国内外政府资金投入情况


1. 国外政府投入情况

目前,美国、欧盟等发达国家和地区政府对单细胞测序领域投入了大量资金,用于促进单细胞测序技术的优化与各个领域的应用[6]

自2008年起,美国开始资助单细胞测序相关项目,之后一直呈现平稳增长趋势。自2014年起,关于单细胞测序的经费数及项目数量骤增,呈爆发性增长趋势,表明美国近几年对单细胞测序相关项目的重视。共资助 915 个项目,累计经费 5. 39 亿美元。

另一方面,资助方向主要包括研究领域和应用领域,可细分为分子和细胞基础研究,感染性疾病、肿瘤、心血管与血液病和神经精神疾病研究,再生医学与干细胞研究,生物多样性研究,单细胞测序相关工具、方法的建立,试剂与仪器设备的开发,资源与平台的建立等。

2. 我国政府投入情况

我国单细胞测序技术起步较晚,2010年,NSFC资助2个细胞测序相关研究项目,经费77万元。2013 年,随着国际对单细胞测序领域的热度提升,NSFC 投入1500 万元用于相关研究,2014—2015 年资助项目数及资助金额虽然稍有回落,但2016 年又迅速增加至23项,超过2000 万元。

研究领域主要包括单细胞测序仪器和技术开发、肿瘤研究与监测、胚胎发育、微生物基因组研究、医学免疫学、干细胞研究、神经科学、在畜牧学、兽医学中的基础和应用研究、血液疾病等。
 
3. 国内外政府资金投入比较


目前,我国 NSFC、“863 计划”和国家重点研发计划累计在单细胞测序领域资助经费约 1 亿元,明显低于美国不完全统计的 5.4 亿美元,甚至英国的4千万英镑。

图4  美国和中国对单细胞测序技术的资金投入情况

数据来源:参考文献[6]


小结


单细胞测序以单个细胞为单位,通过全基因组或转录组扩增,进行高通量测序,能够揭示单个细胞 的基因结构和基因表达状态,反映细胞间的异质性,在肿瘤、发育生物学、神经科学等领域发挥重要作用,正成为生命科学研究的焦点。

单细胞测序技术在生物多样性研究和细胞群体遗传异质性研究方面具有强大优势,将为生命科学研究人员提供全新的视角研究生命活动。我国在单细胞测序相关项目中的资助力度仍显不足,随着单细胞测序技术的深度和广度逐渐加强,仍需加大对该领域的资金支持,并充分利用现有资源推动单细胞测序技术的进步与应用。
 
参考文献


[1] 朱忠旭,陈新.单细胞测序技术及应用进展[J].基因组学与应用生物学,2015,34(5):902-908.
[2] 董燕,宋程程,黄鹤.单细胞测序技术研究进展[J].化学工业与工程,2015,32(1):71-78.
[3] Xu X, Hou Y, Yin X, et al.Single-cell exome sequencing reveals single-nucleotide mutation char-acteristics of a kidney tumor[J]. Cell, 2012, 148(5): 886-895.
[4] Zhong S, Zhang S, Fan X,et al.A single-cell RNA-seq survey of the developmental landscape of the human prefrontal cortex [J].Nature,2018, 555(7697):524-528.
[5] Suzanne D L, Bruer S L, Edgmont C A, et al .Ubiquitous dissolved inorganic carbon assimilation by marinebacteria in the Pacific Northwest coastal ocean as determined by stable isotopeprobing[J].PloS One,2012(7): e46695.
[6]李爱花,唐小利.美、英及我国政府对单细胞测序研究及应用领域的基金资助[J].中华医学图书情报杂志,2017,26(9):44-51.
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