近年来，CRISPR技术因其颠覆性的疾病治疗潜力而备受关注。其中，CRISPR-Cas9系统以精准切割DNA片段而闻名，但作为一种应用广泛的研究工具，CRISPR-Cas9系统还拥有强大的基因定位能力，并催生出了一条疾病诊断的新赛道。 如今，美国初创公司Cardea Bio和Nanosens Innovations的研究人员将该领域向前推进了一步。今年早些时候，两家公司将生物技术与纳米电子技术结合，联合开发出了一种基于石墨烯晶体管的CRISPR-Cas9生物传感器诊断设备——CRISPR芯片（CRISPR-Chip），并证明了该芯片在检测杜氏肌营养不良症（DMD）特定基因突变方面的实用性。 
图：CRISPR芯片，来源：凯克研究院据悉，该手持装置利用CRISPR的基因靶向能力，将一种部分失活的Cas9蛋白（dCas9）与特异性的单链gRNA复合并连接到基于石墨烯的晶体管上，实现核酸检测功能。基于相同的原理，研究人员还希望利用该芯片开发出更多疾病的诊断方法，并拓展其在农业及科研方向的应用。近年来，科学家们利用石墨烯开发半导体进行癌症研究或制造轻量纤维。石墨烯晶体管良好的生物相容性等特点使其在纳米电子生物传感领域拥有广泛应用前景。Cardea公司首席执行官Michael Heltzen表示，石墨烯芯片能够非常快速地检测特定突变、蛋白质或其他成分。这种方法的优点是，允许研究人员在DNA的自然状态下进行检测，而无需扩增和昂贵的光学仪器。此前该公司的研发团队利用五年时间优化了大规模生产基于石墨烯的抗原芯片的工艺。随后他们希望继续进行核酸检测，但与简单的抗体检测相比，读取DNA和RNA会更有难度。美国凯克应用生命科学研究生院助理教授、首席研究员Kiana Aran也遇到了相关问题。自在2011年，她开始使用石墨烯开发半导体生物传感器，她发现这种材料较硅更为灵敏。“我喜欢它，因为它不仅极其灵敏，而且比硅基晶体管更容易功能化，因为你可以修改石墨烯表面的化学成分，并附着任何你想要的生物分子。我们可以利用这种能力进行非常灵敏的生物学操作。”她补充说，将CRISPR- Cas复合物覆盖到石墨烯晶体管上的想法似乎更加可行，因为CRISPR的主要功能是搜索和发现特定的DNA片段，使用失活的Cas9蛋白则仍然能够搜索并与特定的DNA片段相结合，但无法切割DNA。当CRISPR晶体管使用dCas9在生物样本中搜索特定靶点时，如果靶点存在，那么生物相互作用产生的电荷就会被石墨烯感知并发出信号。整个过程则无需PCR扩增。今年3月发表在Nature Biomedical Engineering的一篇文章中（查看此前报道），Kiana Aran的研究团队与Cardea Bio和Nanosens Innovations的合作者展示了一种用于疾病诊断的CRISPR芯片的效用，并证明了该芯片可以快速、选择性地检测基因组中的DNA靶序列。研究团队使用该装置对来自DMD患者血液样本中的两种常见基因突变进行了检测。在靶基因存在的情况下，CRISPR芯片能够在15分钟内产生灵敏度为1.7 fM的输出信号，相较于缺乏靶序列的样品，输出信号显著增强。此外，该芯片的检测限低于此前报道的用于检测靶序列的无扩增技术，其速度和简单性表明其有可能在未来常规应用于临床中。值得关注的是，在今年6月发表于Nature Biomedical Engineerin杂志发表的另一篇评论文章中，来自弗莱堡大学和伦敦帝国理工学院的研究人员指出，该CRISPR芯片能够利用dCas9与不同sgRNA的复合物来检测单个样本中的多个核酸目标序列。但在一个芯片上实现多个基于石墨烯的gFET阵列，就需要在空间上分离不同的dCas9-sgRNA复合物，这可能会增加设备的成本和复杂性。Kiana Aran与两家公司的研究团队表示，他们已经在解决相关问题，并试图找出最有效的方法来构建可以检测任何目标序列的芯片。例如，可以将多个Cas酶应用到单个芯片上，将多个gRNA应用到每个CRISPR复合物中进而一次识别多个目标序列，或者将一系列芯片连接在一起，最终创建出一台小型诊断设备。Kiana Aran提到：“我们正在研究其他Cas酶并监测它们是如何工作以及如何与石墨烯相互作用的。Cas酶还有很多能力尚未开发。”此外，Cardea公司目前正在测试CRISPR芯片检测各种疾病的能力。Heltzen表示：“某些分析在没有DNA扩增的情况下比其他分析更难实现，因此一些疾病可能更难进行检测。”此前的研究表明，Cas9本身可以用来放大目标序列。基于此发现，Cardea公司正致力于研究在芯片上直接放大DNA信号的可能方法。研究团队也正在解决CRISPR芯片的样本制备问题。通常研究使用来自血液血浆等的纯化生物样本。其研究团队正在开发一种样本制备试剂盒，该试剂盒可以帮助用户根据需要纯化样本，并与CRISPR芯片一起销售。最终，研究团队希望可以利用该设备在医院进行即时的疾病诊断并得到美国FDA的批准。Heltzen强调，Cardea公司不仅是生产并销售芯片产品，还希望了解其他公司机构的需求并与之合作，为特殊应用构建特定的CRISPR石墨烯芯片。目前，该公司已经建立了一项创新合作计划。通过该计划，该公司将接受潜在合作伙伴的建议，然后与其他公司进行系统讨论以确定客户需求。他认为，该公司的价值在于能够创建一种几乎即时的、比现有光学技术简单得多的检测技术。另外一点值得关注的是，CRISPR芯片不仅具有诊断疾病的潜力，还可以用作研究工具测试其他基于CRISPR的技术以及gRNAs的优化开发和结合强度、保真度的检测。无论是作为评估质量的工具，还是作为基于CRISPR疗法的伴随诊断，都强调了CRISPR芯片未来可能各种各样的应用场景。目前，在基于CRISPR的疾病诊断领域，CRISPR技术先驱、加州大学伯克利分校Jennifer A. Doudna教授在2017年也创立了Mammoth Biosciences公司。该公司将利用CRISPR技术完成传染病、肿瘤学和基因突变方面的快速诊断。而就在今年3月22日，张锋参与组建的Sherlock Biosciences公司成立，并获得了3500万美元的融资。该公司获得Broad研究所技术授权并开发基于CRISPR的快速诊断方法。随着精准医学的蓬勃发展，基因检测已经成为临床医师及遗传学专家寻找致病基因突变的利器。快速、准确、经济、简便是未来理想基因检测发展的重要方向。基于CRISPR开发的体外诊断技术入选2018年世界十大科技进展。这种检测方法使新一代快速诊断成为可能，并且可能比目前技术更具成本效益。我们也期待，这一赛道上能够出现更多中国企业的身影，最终造福更多患者。CRISPR-Chip Shows Potential for Disease Dx, Agricultural, Research Applications | 
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