均相化学发光技术的前世今生

二十一世纪随着生命科学技术的飞速发展，临床化学免疫分析经历了放射免疫，酶联免疫到现在的化学发光免疫，检测技术的一步步革新将原来的手工操作带入了全自动检测时代，其检测结果的精密度和准确度也越来越高。

其中90年代初由美国科学家Ullman教授发现，并由美国德灵公司开发的LOCI(Luminescent oxygen channeling immunoassay)诊断技术，以其独特的能量转移机制和化学发光原理实现了均相免清洗，快速，高灵敏和高通量检测，并可应用于基础医学研究，DNA分子检测，食品安全以及新药开发等领域。

美国PerkinElmer公司则基于该技术开发的Alphascreen/Alphalisa至今在药物筛选方面扮演着重要的角色。遗憾的是随着德灵公司在2007年被西门子诊断以70亿美金收购后，LOCI技术的发展创新出现了停滞。

而在国内由赵卫国博士于2004年创建的博阳生物（后被科美诊断于2014年收购）首次将该技术引进国内，并开发了高通量的大型化学发光系统LICA技术平台，其在传染病项目上表现非常出色。随后于2016年成都爱兴生物在LOCI技术的基础上做了进一步创新，提升了单体氧的能量转化效率并将其应用于均相化学发光POCT系统，已取得7项产品注册证，并自主拥有核心原料和相关知识产权。

科美诊断的LICA500光激化学发光平台

爱兴生物的LIA-12均相化学发光POCT检测平台

均相化学发光技术是一种基于两个纳米微球利用单线氧能量的短距离扩散，激发已形成的相邻位点的化学发光反应来测定生物分子之间的相互作用，它最关键的特征在于它是一种非放射性的，均相的检测分析方法，由捕获微球上生物分子的近距离结合，从一个微球到另一个微球发生了能量转移，通过化学反应并最终产生发光信号。

要了解信号是如何产生的，必须从了解微球开始。

每个发光测定包含两种微球类型：供氧微球和受氧微球。其中两种微球的表面都修饰了多糖水凝胶，使其非特异性结合和自聚集降低到最小化，并带有大量的活性基团便于和生物分子进行化学偶联。

微球是乳胶基质，直径200nm相比较基于磁珠（一般是1um和3um）的化学发光，其微球表面积成倍的增加,通常以比磁珠低得多的浓度使用，可以偶联更多的生物分子，在成本效应方面有显著的优势。微球密度（1.05g/cm³）接近于水，可以永久在水相中呈悬浮状态而不会沉淀在生物缓冲液中，并且可以使用自动液体处理装置容易地分配微球悬浮液而不会堵塞针头。

微球试剂可通过离心或者超滤来清洗，偶联生物分子后的纯化不需要色谱分离，从而获得高产率和易用性。此外即使在高温下（例如PCR用于95℃）以及冻干形式，微球试剂的表现也是非常稳定的。

均相发光原理基于每种微球内部都填充了不同的化学有机染料混合物，供氧微球含有光敏剂酞菁染料，在680nm红光的照射下，将周围环境里的氧分子转化成一种高能态活跃的单体氧(SingletOxygen)。

请注意，单体氧不是自由基，它是具有单个激发电子的单线态氧，与其他受激发分子一样，供氧微球释放出来的60000个单线态氧在回落到基态之前的寿命有限，在其4微秒半衰期内，它可在溶液中扩散的距离约为200nm。当待测物质与双抗体发生免疫反应，形成免疫复合物，其中的受氧微球与供氧微球距离小于200nm，单线态氧就会触发受氧微球里的二甲基噻吩衍生物和稀土螯合物，继而通过一系列的化学反应，最终在610nm左右产生很强的光信号。

光信号与被检测物浓度呈正相关，仪器通过浓度－相对发光值（RLU）的校准曲线，即可计算出样本中待测物质的浓度。如果样本中没有待测物质，供氧微球与受氧微球的距离将大于200nm，单线态氧降至基态且不产生信号，所以不用任何清洗，也不会带来任何的背景干扰。

均相化学发光技术集合了有机化学、高分子材料，免疫学、分子生物学，激光技术、氧自由基能量传递技术等优点，相较其他分析检测技术有着突出的优势。

高灵敏度，宽检测范围

发光信号（以每秒计数，或cps）是级联反应，其由于供氧微球内部的高浓度光敏剂在680nm激发下，每个供氧珠每秒可以释放多达60,000个单线态氧分子，从而产生非常高的信号放大。由于信号放大级联反应产生的强信号，它能够检测低至飞摩尔浓度的生物结合发生的分子相互作用。

非常低的背景

背景非常低（空孔大概100 – 200cps ），这有三个原因：

首先，以时间分辨模式进行测量，这几乎消除了所有荧光背景。

 其次，读取信号的波长615nm低于激发波长680nm，存在上转换模式，避免了如血红蛋白、胆红素等杂质对检测信号的干扰，并最大程度降低了检测信号的背景值。 

第三，由于照射波长在680nm处非常长，因此很少有生物或测定物质会干扰，几乎没有来自背景的自发荧光，这使得均相发光技术成为了一种高度灵敏和强大的分析技术。

精密度好

均相发光的发光效应取决于单分子氧的能量传递，而光敏剂和发光剂并不产生损耗，在一定时间内可重复检测，结果非常稳定。由于免除了非常复杂的磁珠清洗步骤，所以精密度有了很大的提升，其综合CV可以达到5%以内甚至更低。

小型化

均相发光技术可以轻松实现小型化，样本量理论可以低至5μL或更低，并不会改变试剂浓度，无需进行分析重新优化，也不会牺牲分析稳定性，只需将所有试剂的绝对量减少相同的百分比，然后将其转移到微孔中进行测定即可。

成本效益

由于均相发光产生的光信号极高，所以S/N信噪比就会表现突出，由于这种强信号低背景组合，其成本优势也是非常明显的，加上不需要清洗液、激发液、底物液，极大降低了耗材成本。

技术多样性和通用性强

使用均相发光技术可以实现分析设计的极佳多功能性，酶活性，受体-配体相互作用，低亲和力相互作用，功能性GPCR研究，DNA，RNA，蛋白质，肽，碳水化合物，小分子，大分子或具有极大不同大小的结合伴侣都可以用均相发光技术来测定。一般的而言每个微球受体的数量是300-500个抗原抗体，2000-4000链霉亲和素或400-700寡聚核苷酸。

分子诊断的应用

简单操作和低成本的检测核酸目标物在分子诊断中仍然是一个挑战，均相发光技术可以与合成的寡聚脱氧核苷酸结合，并通过连接探针与不同的DNA靶分子进行杂交。这些接有寡聚物的LOCI颗粒在PCR（聚合酶链反应）反应中能够在热循环中存活下来并且可以通过实时和终点法对DNA目标分子进行定量检测，可以有效的控制PCR携带污染和易于自动化的双重优点。

当然，均相化学发光技术也不是一个完美的技术，它也存在着一定的缺陷和不足之处。

譬如光氧微球都有其理论上的最大结合力，当微球达到最大结合力时，结合的蛋白处于饱和状态，任何多余的蛋白都不会在与微球结合。当微球达到饱和状态时，就会产生“钩状效应”(hook effect)，它是一种常见的现象，普遍存在于任何使用双抗体夹心法的检测实验中(例如ELISA实验)，加上该技术彻底的免清洗，所以对于需要间接法或者酶动力学实验的检测是无法进行的。

但对大部分项目而言，高浓度的检测已经没有太大意义，临床也很少会碰到这种情况，并可以通过对试剂或者样本稀释拉伸作用来减少这种干扰。

总之，均相化学发光技术是一种灵敏的检测方法。由于其均相、免清洗的技术优势，使得检测结果精准，检测更加快速便捷，它能够提供更宽泛的动态范围，更敏感的检测低结合力物质间的相互作用，它可以进行多种检测方式的组合，可重复，成本低，易于智能化，自动化。

未来随着厂家和相关领域的科研工作者对LOCI技术的不断探索和发掘，其应用范围也会越来越广，笔者相信在不久的将来均相化学发光技术或将成为继酶促化学发光、直接化学发光、电化学发光之后主流的化学发光检测方法学之一。

作者：程敏卓

爱兴生物联合创始人