体外诊断之等温扩增技术平台研究报告

一、引言

自从1940s核酸被认为是遗传物质起，科学家把更多的注意力投向了核酸的研究，核酸科学也成为了全球生命科学与医学领域的核心研究方向。这种由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，广泛存在于所有动植物细胞、微生物体内，为生命的最基本物质之一。因此，核酸常常被用来作为生物研究和医疗诊断的重要生物标志物。

聚合酶链式反应（PCR）是第一个也是最受欢迎的用于扩增及低丰度检测核酸扩增技术，并在近几十年中得到广泛的应用。但是，PCR需要的反复加热和精密仪器限制了PCR的应用场景。等温核酸扩增技术无疑是一个好的解决方案，因为其只需恒温装置（例如：水浴锅），便能进行快速且高效的扩增反应。近年来，等温核酸扩增技术迅猛发展，多种等温扩增方法都具有高灵敏度，而且有部分技术已成功转向商业化。

在众多的等温扩增技术中，环介导等温扩增技术应用范围较为广泛，其他的等温扩增技术还有依赖核酸序列型等温扩增、链置换等温扩增、滚环等温扩增、单引物等温扩增、交叉引物等温扩增。

因此，本文研究重点：

（1）各类等温扩增技术原理介绍；

（2）各类等温扩增技术对比；

（3）等温扩增技术平台市场规模及前景；

二、等温扩增技术分析

体外核酸扩增是分子生物学研究的基础，1983年人类第一次能够在体外扩增DNA之后，对核酸的操作和利用进入了一个全新的革命性的阶段，其中，Mullis K等在20世纪80年代建立的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)应用最为广泛。在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，PCR通过变性、退火和延伸3个步骤特异地扩增目的片段。

常规PCR技术存在以下缺陷：（1）PCR仪价格昂贵，对精良设备依赖度高；（2）影响扩增因素众多；（3）耗时较长等。因此，限制了其在基层的推广使用。等温扩增技术(isothermal amplification technology，IAT)是一类更具特色的核酸扩增技术，通过不同的酶和特异性引物在恒定温度下进行快速扩增。与PCR方法相比，等温扩增技术使用的仪器设备简单且扩增时间大大缩短，在临床和现场快速诊断中显示了其良好的应用前景。

根据反应原理的不同，等温扩增可分为环介导等温扩增(100p-mediated isothermal amplification，LAMP)、依赖核酸序列的等温扩增(nucleic acid se—quence—based amplification，NASBA)、依赖解旋酶的等温扩增(helicase—dependent amplification，HDA)、链置换等温扩增(strand displacement am—plification，SDA)和交叉引物扩增(cross—primingamplification，CPA)等。这些技术各有优缺点，在病原及细菌检测中有不同的应用。

2.1.环介导等温扩增技术（LAMP）

（1）技术原理

环介导等温扩增(LAMP)是Notomi等于2000年开发的在恒温条件下仅用一种酶进行核酸快速扩增的技术。

①引物设计：针对靶基因3’端的F3c、F2c和Flc区及5’端的B1、B2和B3区6个特异位点设计4种引物，上游内引物FIP由Flc和F2组成，下游内引物BIP由Blc和B2组成，上游外引物F3与F3c互补，下游外引物B3与B3c互补。

②哑铃状模板构造的形成：FIP引物中的F2序列与模板DNA上F2c结合，在链置换DNA聚合酶的作用下向前延伸并启动链置换反应，外引物F3与模板F3c区域结合，共同置换出FIP延伸的单链，此单链上F1C与F1互补，碱基配对形成环状结构。以此链为模板，BIP引物与其结合并延伸，同时环状结构被打开。随后，B3在聚合酶作用下置换出新的互补链，被置换的单链两端均存在互补序列，可发生自我碱基配对形成哑铃状DNA结构。

③扩增循环：以哑铃状结构为模板，FIP与其F2c区结合开始链置换合成，通过再循环和延伸得到长度不同的DNA产物。整个过程在63℃左右45min ~ 60 min即可完成。

LAMP扩增产物的检测方法多种多样，包括琼脂糖凝胶电泳法、浊度检测法、颜色判定法，而颜色判定法所用显色剂又分两类：一类是金属离子指示剂，如钙黄绿素、羟基萘酚蓝（HNB）、钙黄绿素和HNB 的组合等；另一类是核酸染料指示剂，如SYBR Green I、GeneFinder 和碘化丙啶等。

LAMP与以往的核酸扩增方法相比具有如下优点：

1.操作简单，LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，对于中小医院只需要水浴锅即可，产物检测用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度即可判断。对于RNA的扩增只需要在反应体系中加入逆转录酶就可同步进行(RT．LAMP)，不需要特殊的试剂及仪器。

2.快速高效，因为不需要预先的双链DNA热变性．避免了温度循环而造成的时间损失．核酸扩增在l h内均可完成，添加环状引物后时间可以节省1／2，多数情况在20。30 rain均可检测到扩增产物。且产物可以扩增至109倍，达0.5 mg／mL．应用专门的浊度仪可以达到实时定量检测。

3.高特异性，由于是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异性极高。

4. 高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数量级的差异。

（2）发展与应用

最初LAMP引物设计采用2对引物识别6个位点，后来Nagamine K等建立了一种通过加入额外的引物(环引物)加速LAMP反应的方法。改进的LAMP方法采用环引物，反应时间比原始LAMP方法缩短一半。虽然内引物和环引物都通过环反应，但它们的反应机制不同。

新研究出一种新型的逆转录LAMP检测方法，在LAMP反应混合体系中加入病毒逆转录酶，实现一步法扩增，可快速检测非典型肺炎（SARSV）。结果显示，RT-LMAP最低检测限为0.01 pfu，而RT-PCR只能检测1 pfu，因此，RT-LAMP的灵敏度较RT-PCR提高100倍；RT-LAMP的检测特异性是100%，而RT-PCR是87%。

近年来，LAMP已用于多种细菌和病毒的检测。其中将RT-LAMP与化学发光结合建立的H7N9病毒检测方法，经优化可检测到103拷贝/mL的H7N9流感病毒RNA，与RT-PCR-CL相比，处理时间显著缩短。同时LAMP还可与胶体金试纸条联合，在1对内引物中间设计1组探针，扩增产物直接用试纸条检测，使检测结果更直观、易于判定。

2.2.依赖解旋酶的等温扩增技术（HDA）

（1）技术原理

依赖解旋酶等温扩增技术（HDA）是由美国NEB公司研发人员VincentM等在2004年建立的一种模拟生物体内DNA自然复制的扩增技术。

HAD扩增过程可分为5个阶段：解旋酶解开DNA双链；单链DNA结合蛋白（SSB）结合其上得到完整的单链DNA；引物结合；聚合酶催化合成靶序列和解旋酶解新链再循环。

反应初，在辅助蛋白的辅助下解旋酶与双链DNA结合，把双链DNA解成单链；体系中的SSB马上与产生的单链DNA结合，防止单链重新形成双链；同时引物与单链结合，在聚合酶的催化下合成靶序列。新合成的序列作为模版进入新一轮扩增，经过不断循环，目的片段呈指数增长。

（2）发展与应用

为提高HDA反应效率，研究人员从细菌中提取到一种耐热的解旋酶(Tte—UvrD)，可在60℃～65℃扩增目的片段，体系不需添加DNA错配修复蛋白MutL和SSB。该方法已应用于痰液、胸膜液和尿液样品中结核分支杆菌的检测，通过磁珠捕获扩增的DNA序列，进行扩增后杂交试验，以提高灵敏性和特异性。同时，还可以利用热稳定的HDA体系建立一种检测RNA片段的扩增方法。

另外，通过对T7噬菌体复制机制的研究，在最初反应体系的基础上又建立了一种高效快速的HDA检测方法，称为环状HDA体系(circularHDA system，cHDA)。T7噬菌体复制系统可以扩增环形DNA和长达10 kb的目的片段。Sch—wenkbier L等成功将磁珠法提取植物DNA、HDA和DNA芯片杂交技术相结合，建立了一种植物疫霉的现场快速检测方法，最低检测限可达10 pg／uL。

2.3.依赖核酸序列的等温扩增技术(NASBA)

（1）技术原理

依赖核酸序列等温扩增(NASBA)是一种由Compton J报道的可对RNA序列进行扩增的新技术。反应体系包括AMV逆转录酶、噬菌体T7 RNA聚合酶、RNase H和2种特别设计的特异性引物等。RNA模板链进人反应体系后，含有T7启动子的引物P1先与模板链3’端结合，在逆转录酶作用下合成互补链，然后RNase H降解与DNA杂交结合的RNA链，随后引物P2与单链DNA的3’端结合并延伸，最后依赖于DNA的T7 RNA聚合酶通过识别双链DNA上的T7启动子合成大量RNA补偿链，反应循环进行。NASBA还可用于DNA的扩增，即在扩增前将DNA加热变性，再依原理加入相应的酶进行反应，扩增产物仍然是RNA。

（2）发展与应用

基于NASBA的一系列优点，该技术已应用于病毒、细菌和寄生虫等研究中。植物细胞壁中含有大量多糖、酚类物质，提取植物病毒RNA也存在着稳定性差和效率低等问题，而RNA本身容易降解，导至最终提取的RNA病毒含量较低，对检测方法的灵敏度和稳定性要求较高。而NASBA技术将反转录和扩增反应一步完成，适合各种RNA样品的分析。因此，NASBA技术与分子信标结合建立了草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus，SVBV)的检测方法，其灵敏度可达1 ng。

侵袭性曲霉菌(Invasive aspergillosis，IA)可危及免疫受损患者的生命，因此对早期感染患者快速、灵敏的检测至关重要。Du L等建立了检测曲霉菌的NASBA—ELISA方法以满足需要。在高度保守的18 S rRNA区域特异位点处设计引物，并标记地高辛(digoxigenin，DIG)，DIG标记的RNA扩增产物与固定在链霉亲和素包被的微量滴定板上的特异性生物素化DNA探针杂交，通过加入与ALP和底物(磷酸4一硝基苯酯二钠)连接的抗DIG抗体来比色检测杂交体。NABSA—ELISA方法的检测限为1CFU，与其他细菌和真菌无交叉反应。与RT—PCR和半乳甘露聚糖(galactomannan，GM)相比，NASBA—ELISA、RT—PCR和GM-ELISA的灵敏度分别为80．56％、72．22％、58．33％，特异性为80％、84％、82％。总之，NASBA与ELISA结合，可用于大规模样品检测并有半定量结果，具有很好的参考价值。

2.4.链置换等温扩增技术(SDA)

（1）技术原理

WalkerG T等于1992年报道了关于链置换扩增(SDA)的研究，标志着一种新的核酸等温扩增技术的诞生。反应体系包括限制性核酸内切酶、链置换DNA聚合酶、两对引物等。反应包括3个阶段：①引物与DNA单链上对应的靶DNA序列结合，使靶DNA两端带上被化学修饰的限制性核酸内切酶识别序列；②核酸内切酶在其识别位点将DNA链打开缺口，DNA聚合酶在缺口处向3’端延伸并置换出DNA单链；③被替换下来的DNA单链可分别与引物结合并延伸形成双链。在37℃条件下反复循环2 h，扩增靶序列的拷贝数可达108。

（2）发展与应用

SDA在疾病和基因诊断等方面已有报道。为了弥补其缺点，将缺口酶Nt．Bst—NBI代替限制性内切酶，通过体系优化建立了一种低成本的新型检测方法，可在30 rain内检测到2 pmol／L的质粒DNA，具有很好的应用前景。

将SDA与电化学传感技术联用构建核酸多酶标记体系，建立了一种高效、快速的miRNA检测方法。利用磁性纳米颗粒作为液相检测的微载体，将探针连接至微载体后体系中的miRNA与微载体上的探针结合，可将引物与聚合酶连接到探针上进行延伸并进入循环扩增。扩增结束后，加入链霉亲和素标记的碱性磷酸酶(streptavidin-alkaline phosphatase，Sa-ALP)通过磁性分离，可在磁性颗粒上标记大量酶而产生酶促产物抗坏血酸，经电极氧化为脱氢抗坏血酸，最终检测产生的氧化峰电流。该方法检测限为9 fM，与荧光定量PCR结果一致。

针对SDA必须使用修饰过的dNTP的问题，优思达公司研发出一种切刻内切酶等温扩增技术(nicking enzyme mediated isothermal amplification，NEMA)，将限制性内切酶用嗜热切刻内切酶替换，该方法不但减少成本，还能扩增长片段。已建立了检测蜡样芽胞杆菌质粒的NEMA技术，得到450 bp的扩增产物。目前，已经开发出NEMA试剂盒并获得专利。

2.5.交叉引物等温扩增技术(CPA)

（1）技术原理

交叉引物扩增技术(CPA)是杭州优思达生物公司新研发的一种等温扩增技术，中国首个具有自主知识产权的核酸扩增技术[2 4|。根据交叉引物数量的不同，CPA可分为双交叉扩增和单交叉扩增。

双交叉引物扩增包括3对引物(两条交叉引物、两条剥离引物和两条探针)、Bst DNA聚合酶、甜菜碱及其他必要成分。正向交叉引物中的1s与模板互补序列结合，在链置换DNA聚合酶的作用下完成延伸，剥离引物3s将合成的DNA单链置换下来，反向交叉引物2a与其结合并延伸，经剥离引物4a置换，即可产生带有交叉引物位点的扩增产物。以带有交叉引物位点的扩增产物为模板，通过交叉引物和DNA聚合酶的循环杂交、延伸，就可得到大量重复带有交叉位点的扩增产物。

图：CPA双交叉原理图

单交叉引物扩增体系中只有一条交叉引物，首先交叉引物中的1s与模板互补序列结合延伸，剥离引物4s置换出新合成的单链，将2a引入到扩增产物中，在链置换DNA聚合酶作用下，以新合成的单链为模板，引入特异引物3a、2a，得到两条不同的单链DNA。2a和交叉引物分别与单链DNA产物迅速结合并延伸，形成两条不同长度的产物。以此产物为模版，引物物1s或3a、2a与其结合、延伸，不断循环杂交，最终得到大量扩增产物。

图：CPA单交叉原理图

（2）发展与应用

为解决开盖检测带来的污染，优思达公司发明一次性核酸检测装置，并相继研发了多种检测试剂盒。已成功建立炭疽芽孢杆菌的CPA检测方法，其灵敏度可达5.4 pg，对炭疽疫苗株的检测限为6 X 10³ CFU/mL，与其他相似菌株均无交叉反应。表明建立的方法特异性好，灵敏度高，可应用于国境检疫及公共卫生安全领域。

为解决假阳性问题，杭州优思达生物公司研制了一次性检测装置，等温扩增反应阶段及检测阶段均在密闭的检测装置内进行，避免开盖带来的污染，有效解决了气溶胶带来的污染问题。