从IVD试验员到项目经理（53）：说说体外诊断试剂参考区间的研究

最近有群友（Q群号49922581）发来私聊问如何在一个特定产品的研制阶段做参考区间的研究，翻了翻自己过往所撰写的相关内容确实没有把这方面的东西写下来。那么今天就抽点时间来说说体外诊断试剂的特定产品要如何进行参考区间的研究。

首先，我要说一件事情，在现行的《体外诊断试剂注册管理办法》中这样规定：

第十二条　体外诊断试剂产品研制包括：主要原材料的选择、制备，产品生产工艺的确定，产品技术要求的拟订，产品稳定性研究，阳性判断值或者参考区间确定，产品分析性能评估，临床评价等相关工作。

在法规的表述中提及的是：阳性判断值或者参考区间。在法规的文本中我没有找到关于“阳性判断值”和“参考区间”的名词解释。之前有人问两者有什么区别，有人说定量产品应表述为“参考区间”，定性产品应表述为“阳性判断值”。个人观点是这两者指向应该是相同的，本质上没有实质的区别，要使用哪个，更多的还是遵从一个特定产品类别的习惯，例如免疫层析法的产品大多数称为“阳性判断值”，而分子诊断类的产品似乎两种说法都有。

好了，闲话少说，还是回归到我们今天要说的正题上来，一个特定的体外诊断试剂产品要如何进行阳性判断值或参考区间的确认呢？我个人比较推荐的方式是参考美国临床实验室标准化委员会《C28-A2 临床实验室如何确定和建立生物参考区间》，这份文件的中英文版本在百度上都可以检索到且可以下载。

NCCLS的C28-A2指南所介绍的方法可以适用于任何的实验室，每个实验室根据不同的产品选择适合的参考人群进行检验分析，并对数据进行汇总、统计之后得到这个实验室的这个检验方法或这个检验产品的参考区间。简单的说：参考区间是一个建立在一定样本量上的临床检测的统计结果，一般情况下应该是不少于120例的健康人群样本的检测结果的95%置信区间内的结果为该实验室该检验方法或检验产品的参考区间。

在参考区间建立的实验过程中应该注意以下几个方面的问题：

NCCLS C28-A2指南中建立参考区间的方法是使用健康人群样本。但对于如何界定健康人群呢？实际上目前没有公认的标准。所以每个实验室建立参考区间时应该设定自己的健康人群的概念，例如：如果实验室认为吸烟的人不易纳入健康人群，那么就应该建立样本排除标准中纳入：吸烟。

在明确了健康人群标准后，还应该根据实验室的拟使用的检测方法所对应的样本类型进行排除，设定样本类型排除标准，只入选拟使用的检测方法适宜的样本及样本类型。

对于任何检测来说存在离群值是比较常见的情况，但并不是所有的离群值都需要被剔除，只有那些明确了在实验过程中存在操作失误或者是已知的样本出现问题的情况下的检测离群值才可以被剔除。保留以上离群值应该是提示实验室在日常检测过程中对检测方法进行关注，如果离群值出现的频次或数量过多且不属于剔除范畴的，说明实验室应该对实验环境、检测方法等非剔除因素进行回顾和分析。

对于参考区间是否要分组这样的问题也是经常被提问的。实际上参考区间是否需要分组是根据分析目标待测物是否有例如：年龄、性别、人种等不同要求来确定的。

对于一个已知的检测疾病的方法或试剂来说，参考区间是否要分不同亚组是比较明确的，但对于一个全新的检测方法或试剂来说可能就不明确，所以在设计参考区间分组时应查阅文献并对显著性例如：年龄、性别、人种等情况进行分析以考虑参考区间是否要分组。

一般认为只要两个分组之间测得的均值的区别具有统计学显著意义（在 5% 或 1% 可信区间），那么每个组别就能保证其自身的参考值区间。

另外，如果明确参考区间需要分组时，每个亚组的入组样本量应保证不低于120例的健康人群样本。所以对于需要分组的检测方法来说，其总体纳入参考区间设定的样本是随着分组的多少而递增的。

参考区间是每个实验室工作必须具备的，每个实验室应该在工作开始前率先建立自己实验室的参考区间，而不是单纯的依靠产品说明书中给定的参考区间。实验室建立的参考区间也需要定期的回顾和分析，特别是当实验条件、环境、设施等发生变化时更加应该重新设定参考区间。

由于建立参考区间是相对比较繁琐和成本高昂的工作，所以对于已经有同类产品上市的项目来说可以参考其同类品种的参考区间的设定值，但无论如何都需要对参考区间进行验证，以确保所设定的参考区间符合当前实验室所选择的分析方法的各项要求。

这里仅仅是对NCCLS的C28-A2指南中的部分内容做了一个简单的介绍。还是建议大家在开展参考区间设定的相应工作前能够去学习一下该指南的原文，各位网友可以很轻松的在网上找到这份指南的中英文文档下载。

对于参考区间的设定方法不止是NCCLS的C28-A2指南所提供的方法。还包括了ROC曲线方法。

受试者工作特征曲线 （receiver operatingcharacteristic curve，简称ROC曲线），又称为感受性曲线（sensitivity curve）。得此名的原因在于曲线上各点反映着相同的感受性，它们都是对同一信号刺激的反应，只不过是在几种不同的判定标准下所得的结果而已。接受者操作特性曲线就是以假阳性概率（False positive rate）为横轴，击中概率为纵轴所组成的坐标图，和被试在特定刺激条件下由于采用不同的判断标准得出的不同结果画出的曲线。

ROC曲线是根据一系列不同的二分类方式（分界值或决定阈），以真阳性率（灵敏度）为纵坐标，假阳性率（1-特异度）为横坐标绘制的曲线。传统的诊断试验评价方法有一个共同的特点，必须将试验结果分为两类，再进行统计分析。ROC曲线的评价方法与传统的评价方法不同，无须此限制，而是根据实际情况，允许有中间状态，可以把试验结果划分为多个有序分类，如正常、大致正常、可疑、大致异常和异常五个等级再进行统计分析。因此，ROC曲线评价方法适用的范围更为广泛。

1.ROC曲线能很容易地查出任意界限值时的对性能的识别能力。

2.选择最佳的诊断界限值。ROC曲线越靠近左上角，试验的准确性就越高。最靠近左上角的ROC曲线的点是错误最少的最好阙值，其假阳性和假阴性的总数最少。

3.两种或两种以上不同诊断试验对算法性能的比较。在对同一种算法的两种或两种以上诊断方法进行比较时，可将各试验的ROC曲线绘制到同一坐标中，以直观地鉴别优劣，靠近左上角的ROC曲线所代表的受试者工作最准确。亦可通过分别计算各个试验的ROC曲线下的面积(AUC)进行比较，哪一种试验的 AUC最大，则哪一种试验的诊断价值最佳。

该方法简单、直观，通过图示可观察分析方法的准确性，并可用肉眼作出判断。ROC曲线将灵敏度与特异性以图示方法结合在一起，可准确反映某分析方法特异性和敏感性的关系，是试验准确性的综合代表。ROC曲线不固定分类界值，允许中间状态存在，利于使用者结合专业知识，权衡漏诊与误诊的影响，选择一更佳截断点作为诊断参考值。提供不同试验之间在共同标尺下的直观的比较，ROC曲线越凸越近左上角表明其诊断价值越大，利于不同指标间的比较。曲线下面积可评价诊断准确性。