盘点单分子分析的新兴工具

千姿百态

阿尔茨海默症和帕金森症这样的神经退行性疾病，都是由微小的毒性蛋白寡聚体引起的。现在，新兴的单分子技术正在帮助人们研究这些蛋白聚合物，为相关疾病的治疗带来新的希望。

阿尔茨海默症被认为是β淀粉样蛋白发生错误折叠引起的。这些蛋白在神经元中累积形成了大量的淀粉样纤维和蛋白斑块，不仅影响了大脑的记忆功能，还威胁着神经元的生命。

然而最近有新证据指出，阿尔茨海默症实际上是少数蛋白在疾病早期聚集的结果。这些蛋白形成了可溶性的淀粉样蛋白寡聚体，而那些长纤维和斑块实际上起的是保护作用，将有毒性的寡聚体隔离起来。

“我们希望能够在疾病的初始阶段研究单分子的相互作用，解析它们形成毒性寡聚体的过程，并找到阻止疾病发展的途径，”滑铁卢大学的副教授Zoya Leonenko说。

“留声机”

研究小分子及其相互作用的方法很多，Leonenko选择了原子力显微镜（AFM）。“AFM是一个理想的工具，可以获得单分子水平上的高分辨率图像，帮助我们解析淀粉样蛋白的寡聚体形成，”她解释道。

Leonenko介绍道，AFM的高分辨率依赖于一个微小的探针，该探针就像留声机上的唱针，在样本表面扫过并同时读取信息。研究人员先令淀粉样蛋白在溶液中聚集，然后将寡聚体放在云母片上进行研究。这种云母的表面非常平滑，以至于探针可以根据其表面的粗糙程度，区分未结合的蛋白单体。

Leonenko的研究团队不仅利用AFM研究淀粉样蛋白的聚集和毒性机制，还希望依靠这一技术进行药物开发。为此，他们将AFM与原子力光谱AFS结合了起来。

在进行AFS分析时，研究人员先将一个β淀粉样蛋白单体放置在云母片上，然后给AFM探针带上另一个β淀粉样蛋白单体。在探针接触云母表面时，探针的单体会接触并结合云母上的蛋白单体。这时研究人员缩回探针，将两个结合的分子拉开，同时检测蛋白单体分开所需的力（即蛋白聚集的结合力）。

“如果在其中加入阻止蛋白单体结合的药物，就能够在单分子水平上检测这种药物的有效性，”Leonenko说。她补充道，与目前的其他药物筛选方法相比，这一方案能够显著降低成本和工作量。单分子测试所需的药物量更少，而且AFS能够在几个小时内完成数百种不同条件和辅助因子的筛选。

“缝纫机”

Lancaster大学的Oleg Kolosov选择了另一种方法来进行阿尔茨海默症研究，超声波原子力显微镜UFM（ultrasonic force microscopy）。

与AFM相同的是，UFM也使用一个探针。不过该技术利用高频震动，可以在探针移动的同时滑动样本，就像是一台缝纫机。

这种方法依赖反差对β淀粉样蛋白的聚合物进行成像。电镜中的反差来自于染色，而UFM的反差来自于微观力学性能上的差异。Kolosov选择了PLL（多聚-L-赖氨酸）作为背景，它不仅允许UFM区分出β淀粉样蛋白，还能将蛋白粘在片层上。

Kolosov通过改良版的UFM跟踪分析了β淀粉样蛋白的聚积过程，发现即使形成了蛋白纤维，毒性寡聚体依然存在。这说明还有许多寡聚体没有参与蛋白的累积过程。下一步，Kolosov打算进一步改良技术以便在液体中进行检测，这样就可以在生理环境下实时监控蛋白的聚积过程。

“小镊子”

Alberta大学的Michael Woodside通过被称为光镊的单分子技术，研究了α-突触核蛋白形成寡聚体的过程，这种蛋白是帕金森症的致病蛋白。

Woodside的研究团队分别构建了一个、两个和四个拷贝的α-突触核蛋白，拷贝之间以linker间隔。随后他们在上述结构的两端添加了DNA把手，一端标记上digoxigenin，一端标记上生物素。最后用抗digoxigenin和抗生物素的聚苯乙烯珠与DNA把手结合，形成哑铃结构。

光镊的激光束能够将微珠固定，文章的第一作者Krishna Neupane解释道，“我们用两股激光分别固定两端的微珠，然后拉开激光束，向蛋白施加拉力。”这时微珠的位置反映了蛋白寡聚体中的结构改变。

这一技术可以为研究人员展示蛋白寡聚体的结构多样性。实际上由于光镊非常敏感，这项研究揭示了更多的寡聚体构造。不过研究人员强调，这些数据只是体现了蛋白折叠的可能性，活体内是否存在上述结构还有待于进一步证实。

Neupane正在用这一技术研究家族性帕金森症的相关突变蛋白。他计划进一步构建六聚体和八聚体蛋白，以便分析更大的聚合物。

上述研究展示了致病蛋白刚开始聚集时的具体过程。在这些单分子分析技术的帮助下，相信不久人们就能解析寡聚体或蛋白纤维的形成过程，以及它们的毒性机制。目前，单分子研究的成果已经为相关疾病研究的发展提供了坚实的基础。Neupane、Leonenko和Kolosov已经开始筛选能够改变寡聚化和蛋白累积的药物。

“对于阿尔茨海默症和帕金森症这样的疾病来说，将生物医学与单分子分析联系起来非常重要，可以帮助人们取得疾病防治的重大进展，”Leonenko说。

参考文献：

1. Hane FT, Lee BY, Petoyan A, Rauk A, Leonenko Z. Testing synthetic amyloid-β aggregation inhibitor using single molecule atomic force spectroscopy. Biosens Bioelectron. 2014 Apr 15;54:492-8.

2. Tinker-Mill C, Mayes J, Allsop D, Kolosov OV. Ultrasonic force microscopy for nanomechanical characterization of early and late-stage amyloid-β peptide aggregation. Sci Rep. 2014 Feb 6;4:4004.

3. Neupane K, Solanki A, Sosova I, Belov M, Woodside MT. Diverse metastable structures formed by small oligomers of α-synuclein probed by force spectroscopy. PLoS One. 2014 Jan 24;9(1):e86495.