时间分辨荧光免疫技术

青草

时间分辨荧光分析法（Time resolved fluoroisnmunoassay,TRFIA）是近十年发展起来的一测微量分析方法，是目前最灵敏的微量分析技术,其灵敏度高达10-19，较放射免疫分析（RIA）高出3个数量级。

　　时间分辨荧光分析法（TRFIA）实际上是在荧光分析（FIA）的基础上发展起来的，它是一种特殊的荧光分析。荧光分析的利用了荧光的波长与其激发波长的巨大差异克服了普通紫外－可见分光分析法中杂色光的影响，同时，荧光分析与普通分光不同，光电接受器与激发光不在同一直线上，激发光不能直接到达光电接受器，从而大幅度的提高了光学分析的灵敏度。但是，当进行超微量分析的时候，激发光的杂散光的影响就显得严重了。因此，解决激发光的杂散光的影响成了提高灵敏度的瓶颈。

　　解决杂散光影响的最好方法当然是测量时没有激发光的存在。但普通的荧光标志物荧光寿命非常短，激发光消失，荧光也消失。不过有非常少的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy)的荧光寿命较长，可达1－2ms，能够满足测量要求，因此而产生了时间分辨荧光分析法，即使用长效荧光标记物，在关闭激发光后再测定荧光强度的分析方法。

　　平时常用的稀土金属主要是Eu(铕）和Tb(铽），Eu荧光寿命1ms,在水中不稳定，但加入增强剂后可以克服；Tb荧光寿命1.6ms，水中稳定，但其荧光波长短、散射严重、能量大易使组分分解，因此从测量方法学上看Tb很好，但不适合用于生物分析，故Eu最为常用。

　　由于常用Eu作为荧光标记，因此增强剂就成了试剂中的重要组成。增强剂原理：利用含络合剂、表面活性剂的溶液的亲水和亲脂性同时存在，使Eu在水中处于稳定状态。现在有些试剂，在络合Eu在抗体上时已考虑了增强问题，而使用了具有增强作用的新络合剂，因而有的试剂没有单独的增强剂。

就拿铕吧
3价铕与双功能螯合剂如EDTA形成稳定的螯合物。
多氨基多羧基类螯合剂螯合剂；一边结合3价铕，一边与蛋白质(抗原或抗体)结合，常用的此类螯合剂有EDTA等。

聚氨基多羧酸酐与氨基芳香羧酸加合物这类螯合剂；一端是环状酸酐，可以和生物分子偶联，另一端是芳香羧酸，可以敏化稀土离子的荧光。常用的此类螯合剂有二乙三胺五乙酸酐(DTPAA)等。

增强液-----一般由p一二酮体、三辛基氧化膦、TritonX一100、醋酸和邻苯二甲酸氢钾(pH2．0—3．2)组成。酸性增强液使铕离子从螯合物中解离下来，游离的Eu“在三辛基氧化膦协同下，重新与B一二酮体形成一种新的能够高效率地接受激发光的螯合物。在激发光激发下，铕离子获能，经过电子跃迁并返回基态，可发射极强的荧光信号。目前，增强液中使用的B一二酮体类螯合剂效果最佳的是B—NTA，其灵敏度可达16x10 mol铕。

蛋白质(抗原或抗体)的标记在TRFIA中，铕离子首先要作为标记物，标记到蛋白质(抗原或抗体)上。标记抗体(或抗原)需要有双功能基团的螯合剂，一侧基团与铕离子螯合，另一侧与抗体(或抗原)上的自由基团连接。抗原(抗体)上的自由基团主要是一NH和一COOH，双功能螯合剂应
能与一NH和一COOH相连。常用的有戊二醛、碳二亚胺(EDC)等。

双位点夹心分析法使用针对被测物上不同抗原决定簇的两个单克隆抗体，一个用Eu“标记，另一个包被固相载体，经过免疫反应形成免疫复合物后，再将铕离子从复合物上完全解离下来，在铕离子的增强液中与另一种螯合剂结合，在协同剂的作用下，形成一个铕离子包裹于其内部的微胶囊(胶态分子团)。它在激发光作用下能发射出很强的荧光信号，其强弱与待测抗原(或抗体)含量相关。该法已用于下列成分的检测：HCG、促甲状腺素(TSH)、促滤泡素(FSH)、促黄体生成素(LH)、催乳素(PRL)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、铁蛋白(ferritin)、p微球蛋白(BMG)、神经元特异烯醇化酶(NSE)、免疫球蛋白(IgE)以及CAS0、CA19．9、CA242等。

固相抗体竞争法其原理是：限量固相抗体与Eu3标记抗原和样品中的待测抗原竞争性结合，样品中的抗原浓度越高，固相抗体结合的Eu“标记抗原量就越少，反之亦然。故固相抗体上的荧光信号强度与样品中的抗原浓度成反比。

双标记法在免疫分析中，常需要同时测定两种或两种以上的待测物。为达此目的，需用不同的稀土离子分别标记多种抗原。用于双标记的元素组合主要有铕和铽以及铕和钐(检测TSH、T等)。有学者同时利用铕、铽组合以及铕、钐组合检测血清中甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)

标记靶细胞Eu”标记技术检测细胞功能，是Eu“标记的一种新的应用。它利用Eu”代替了同位素(cr)作为细胞标记物，灵敏度高，特异性好，测量时间短，可检出少量靶细胞的释放量，重复性好且标记靶细胞稳定。运用Eu“和rI’b“同时检测NK细胞的细胞毒性，步骤简单，整个分析可在一日内结束。

时间分辨荧光免疫技术



第一部份：时间分辨的原理、我国乙肝两对半的流行情况及时间分辨在乙肝两 对半上 的应用技术

一、时间分辨荧光分析（ Time-resolved Fluorescence Immunoassay TRFIA ）的基本原理。

　　TRFIA 是用三价稀土离子及其螯合剂作为示踪物，如 铕 （ Eu3+ ）、 铽 （ Te3+ ）及钐（ Sm3+ ）、 镝 （ De3+ ）等代替传统的荧光物质、放射性同位素、酶和化学发光物质，来标记抗体、抗原、多肽、激素、核酸探针或生物活性细胞，待反应体系（如抗原抗体免疫反应、生物素（链）亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等）发生后，用时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强度，根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。

运用稀土离子及其螯合剂作为标记物，被激发的荧光有以下特点：

1、与普通的荧光比较，稀土离子螯合物荧光的衰变时间长，为传统荧光的 103 ～ 106 倍。从而可以通过延缓测量时间，让短寿命荧光衰变掉后，再测量目标样品，这样可以最大限度地克服来自样品、试剂的自然本底短寿命荧光（通常为 120nS ）及散射光的干扰，大大提高检测的灵敏度。

2、激发光与发射光的 Stokes 位移大，可以达到 200 多 nm ，而普通荧光物质的 Stokes 位移最多也只有几十纳米。这表明，在某一波长测定样品荧光时，可以通过非常简单的方法（如使用滤波片或分光计），就可消除激发光和散射光的干扰；同时，被激发的荧光光带极窄，荧光的发射 峰非常 尖锐，可使仪器调整在极窄的波长范围内测定，极大地降低了来自背景的各种干扰。

3、标记物为原子标记，体积很小，标记后不会影响被标记物的空间立体结构，这既保证了被检物质的稳定性（尤其对蛋白质影响更小），又可实现多位点标记。标记物稳定，就可以对标记物进行多次激发，通过对每次激发的荧光信号累加后（如激发测量 1000 次）取平均值的办法，可以大大减少偶然误差的产生，提高检测的准确度；同时多位点标记技术，不仅使检测更灵敏，也可使用双标记技术使一个试剂盒能够同时检测出两种或两种以上的项目。

　　TRFIA 技术集酶标记、同位素标记技术的优点于一身，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、标记物制备简便、储存时间长、无放射性污染、检测重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽和应用范围广泛等优点，成为继放射免疫分析之后，标记免疫分析法发展的一个新的里程碑，被称之为 " 零本底 " 的检测方法。其灵敏度大大地超过了放射性同位素（如表 1 所示），是目前配基结合分析中最有发展前途的一项 生化超 微量检测手段，非常适用于生物学、医学上的超微量分析。
二、乙肝在我国的流行情况：

　　慢性乙型病毒性肝炎（ Chronic Viral Hepatitis B,CH-B ）是一种严重危害人类健康的疾病，我国是病毒性肝炎的高发区，乙型肝炎病毒（ HBV ）感染率高达 57.63% ，即全国至少有　 6 亿人感染过 HBV 。现在乙肝病人达 2700 万，且每年新发病例近 1000 万， HbsAg 阳性率 9.75% ，约有 1.2 亿人，占全球的 1/3 ，其中约 1/4 将发展为慢性肝病，部分患者可发展为肝硬化，甚至演变为肝癌。据统计每年有 23.7 万人死于乙型肝炎相关的疾病，其中有 15.6 万人死于肝癌。大概有 5%-10% 的成年人和 70%-90% 的婴儿受感染后未能完全清除病毒而成为长期带病毒者，同时亦成为传播根源。
乙型肝炎血清学标志物为检测乙肝病毒感染的最主要病原标志和直接证据之一。在病毒感染缓解和愈合的不同时期，可有不同的存在模式。常见模式乙肝五项指标的临床意义如下：
　　除上述常见模式外，还存在一些非常规模式，包括 HBsAg 与 HBsAb 同时存在的模式。 ( 只在现在 HbsAg 1 μ g / L 以下的人群中 ) 推测二者同存的原因可能是 HBV 发生变异引起 [2] ；近年来亦有发现 HBeAg 可以与 HBeAb 共存的模式，在慢性乙型肝炎伴活动期肝损伤时，几乎 100% 为 HbeAg 、 HBeAb 共存。因之，对乙肝血清标志物的测定对临床有着极其重要的价值。
近年来医学临床和预防的要求对低水平存在的血清学标志物进行有效检测，具有更重要的临床和流行病学意义。研究证实，在部分 HBV 感染的人群中，血清表面抗原呈低水平存在，容易造成漏检。尤其是目前普遍采用的酶标检测方法，对低水平人群更容易造成漏检。在较大范围的非肝炎患者住院人群的检测结果表明，血清 HBsAg 约在 5 μ g/L 以下者占总人群的 2.34% ；占 HBsAg 阳性人群的 23.16% ，其中， HBsAg 浓度在 1 μ g/L 以下的占多数（ 44.40% ） [2] 。多方面研究表明，低水平血清 HBsAg 人群占有不小的比例，尤其我国是乙肝的高发区，加之人口众多，此类人群不容忽视。由于检查方法上的不灵敏，还可导致乙肝病毒通过手术，输血等途径发生传播等严重后果。因此，进一步提高血清 HBsAg 检测的灵敏度有重要意义。

三、时间分辨技术定量检测乙肝两对半的重大意义

　　运用 TRFIA 对乙肝五项进行定量 检测极 大地弥补了酶标法定性检测的不足，成为乙型肝炎血清学标志 物现代 临床检验的发展方向，新波公司为此研制了 HBV 的 TRFIA 试剂盒，并获得国家批准文号，这是一个可喜的成果，它将推动我国乙肝防治工作和进展，同时亦将推动 TRFIA 技术的普遍应用。 TRFIA 在 HBV 感染诊断及免疫力监测方面的定量检测具有如下优越性：

◇ 极大地提高了检测的灵敏度

　　时间分辨荧光免疫定量技术（ TRFIA ）检测 HbsAg 灵敏度可达 0.2ng/ml, 而酶标（ EIASA ）检测的灵敏度是 2ng/ml ，极大地提高检测的灵敏度。因此，在急性乙肝早期能及早检出 HbsAg ，确证 HBV 感染，缩短窗口期；其次，可发现低浓度 HbsAg 携带者；在部分慢性乙肝患者中，由于机体缺乏对 HBV 包膜蛋白的免疫应答， HbsAg 表达较低，酶标检测可出现 HbsAg 和 HbsAb 均阴性的情况， TRF 技术则可避免这些情况的发生，为正确判断病情提供依据。

◇ 能动态观察疗效和监测病情
1 ）定量分析 HBsAg 和 HBsAb 的浓度变化，可预见急性乙肝是否处于恢复期。如 HBsAg 浓度降低， HBsAb 浓度逐渐升高，可说明病情正往恢复期发展；反之， HBsAg 浓度处于较高水平或上升趋势，而 HBsAb 一直处于较低水平，则易发展为慢性乙肝或病毒携带者。

2 ）定量分析 HBeAg 和 HBeAb 的浓度变化，可反映病情变化和治疗效果。定量测定能明确检测 HBeAg 向 HBeAb 转换的时期，即表现为 HBeAg 浓度下降和 HbeAb 升高的过程。高浓度的 HBeAg 还可间接提示病毒处于高复制状态，具有较高的传染性。高浓度的 HBeAb 一方面提示病情好转，而在某些时候（如肝功能指标很差）则可能与肝坏死、肝硬化、肝癌有关。

3 ）HBcAb 浓度的高低可反映病毒感染的状态。高浓度的抗 - Hbc 提示乙肝急性感染，恢复期浓度降低。慢性 乙肝呈抗 - Hbc 持续高浓度。而低浓度的抗 - Hbc 一般为恢复期或既往感染。

4 ）有利于对慢性肝炎活动性或非活动性的判断。非活动性慢性乙肝各项指标相对稳定，活动性往往呈现进行性变化。

◇ TRFIA 和定量 PCR 技术可互相补充

　　血清 HBV-DNA 荧光定量 PCR 测定可以直接反映血液中病毒复制状态，具有很多临床应用价值，但不能完全反映病毒复制静息期肝细胞内 HBV 病毒状态。 HBV-DNA 阴性并不完全代表体内 HBV 已被清除，结合 " 两对半 " 各项指标更能客观反映体内 HBV 病毒状态。

◇ HbsAb 的定量测定能够对乙肝的预防起到监督作用
　　 HbsAb 的定量测定能够对抗体是否真正具有 " 中和 "HBV 的免疫力作出正确评价，对乙肝的预防起到监督作用。 HbsAb 的含量在 10mlU/ml 以上病人 ELISA 检测即可呈阳性结果，但并不提示机体都一定具有免疫力，而 HBsAb 的含量在 10-100mlU/ml 之间的样本，定性虽为 " 阳性 " ，但此时机体对 HBV 的免疫力较弱，甚至不能预防 HBV 感染。只有 HbsAb 的含量达到 100mlU/ml 以上时才可确定具有抵抗 HBV 入侵的作用。作定量检测，可根据 HBsAb 的含量判断机体对 HBV 的免疫状态及乙肝疫苗的免疫效果。因此定量测定对乙肝疫苗免疫力的评价和高危人群预防免疫具有重要意义，特别是在少年儿童预防乙肝方面。

时间分辨除了在乙肝两 对半项目 上的应用外，在以下项目上也有广泛的应用：

一、 内分泌科检查：
甲状腺系列： Ultra TSH, T3, T4, FT4, TBG, TG
糖尿病系列： Insulin ,C- Peptie
生长激素类： hGH
其它： Cortisol

二、妇产科检查
FSH, LH, HCG, Prolactin E2, E3, Testo , Prog , SHBG

三、肿瘤科检查
AFP, CEA, PSA, HTG, β-2 Micro, NSE, PAP, PSA(Free/Total), PSA EQA, CA-50*, CA-125* ,CA-199* ,CA-153* ,CA-724* ,CY-211*

四、 遗传科 检查
产前筛查： h AFP ,/ β HCG , PAPPA
新生儿筛查： Neo- TSH, Neo -T4, Neo- IRT, Neo -17 a - OH, Prog , PKU, G6PD

李严亮

谢谢楼主谢谢楼主谢谢楼主

四正

在慢性乙型肝炎伴活动期肝损伤时，几乎 100% 为 HbeAg 、 HBeAb 共存。

这样的话对乙肝模式的判定就要依靠定量手段了。
假如出现1/2同阳、3/4同阳，该如何判定模式？假如出现1/2/3/4/5同阳的该怎么解释？
最近看了点时间分辨的数据，感觉确实1/2同阳、3/4同阳的比例要比酶免和其他检测方法高，是因为时间分辨的灵敏度高吗？假如是的话，做这么高的灵敏度有什么意义？会不会影响医生对病人病程的判定？

期待做时间分辨的朋友们来解惑。

风行

谢谢分享，我是体外诊断小白

质量学习者

对乙肝模式的判定就要依靠定量手段了