磁珠分离技术在核酸提取中的应用

青草

影响PCR 定量结果除PCR 本身外, 核酸提取效率对聚合酶链反应法准确检测DNA含量有很大影响。所分离的核酸的质量和完整性直接影响研究或诊断结果, 因此核酸抽提是分子生物学最关键的方法之一。
     通常,成功的核酸分离纯化需要四个重要的步骤:组织或细胞的破碎和裂解,核蛋白复合体的变性,核酸酶的灭活以及污染物的去除。理想的抽提方法可以获取高质量的靶核酸, 同时没有蛋白、糖、脂和其它核酸污染。目前已有很多专业化的核酸抽提方法可以从各种生物样品中抽提出D N A 、R N A 或者总核酸。这些方法大多数已开发成商业化的试剂盒, 有的可以与仪器结合实现自动化抽提,从而使抽提过程大为简化。
      一、传统的核酸抽提方法
      传统的核酸抽提方法主要包括异硫氰酸胍一酚一氯仿抽提法、碱抽提法、溴化十六烷基三甲铵(CTAB)抽提法、溴化乙锭一氯化艳(EtB -CsCI )梯度离心法和寡聚脱氧胸腺嗜咤核苷酸一纤维素层析法等。
      1.1 异硫氛酸肌一酚一氯仿抽提法
      酚一氯仿抽提法是核酸分离的一个经典方法。细胞裂解后离心分离含核酸的水相, 加人等体积的酚: 氯仿: 异戊醇(25:24 :l 体积)混合液, 离心后收集上层水相并以异丙醇沉淀其中的D N A , 乙醇漂洗掉盐分后弃去,T E缓冲液或蒸馏水溶解靶D N A 。
      异硫氰酸肌是一种强的蛋白变性剂, 既可以破裂细胞, 也可以抑制核酸酶的作用。该法比较繁琐, 已被C hom cZyllski和saechi(1987) 发明的异硫氰酸肌一酚一氯仿抽提一步法所代替。
      1.2 碱抽提法
      碱裂解法用于分离质粒D N A 和大肠杆菌, 在十二烷基磺酸钠存在情况下,该法可有效处理所有的大肠杆菌菌株和体积在l ml 至500 ml 以上的细菌培养物。该法的原理是基于共价闭合环状D N A 保持双链的同时对高分子量染色体D N A 进行选择性的碱变性；细菌蛋白、破碎的细胞壁以及变性的染色体D N A 形成表面覆盖有十二烷基磺酸盐的大的复合物；经离心，这些变性的物质被去除,质粒D N A 便可从上清中回收。
      1 .3 CTAB抽提法
      CTAB是一种非离子去污剂, 可从低离子强度溶液中沉淀核酸和酸性多糖, 而蛋白质和中性多糖仍留在溶液中。在高离子强度溶液中,CTAB则不会沉淀核酸, 而是和蛋白质形成复合物。因此,CTAB常用于从可产生大量多糖的有机体中纯化核酸, 如植物和某些革兰氏阴性菌。该方法的后续步骤也是通过使用有机溶剂、乙醇沉淀等去除蛋白质!污染的盐和其它物质来纯化核酸。
      1.4 EtBr 一CsCI梯度离心法
      经乙醇沉淀和重悬后, 通过离心, 可将核酸浓缩在EtBr 一CsCI 的一个梯度内。EtBr的插人改变了核酸分子在高摩尔CsCI 中的泳动密度。相对于线性分子,共价闭合环状分子中的每个碱基结合的EtBr 较少, 因此它们会聚集在CsCI 梯度的较低密度区。抽提后用适当的非极性溶剂除去疏水的EtB r,再以乙醇沉淀回收核酸。相对于其它纯化方法, CsCI 梯度离心较为复杂。昂贵和费时,且需要大规模的细菌培养物。因此,该方法不适合于质粒D N A 的小量制备。
      1.5 Oligo(dt)---纤维素层析法
      真核m R N A 的3’末端大都携带有多聚腺昔酸(Pof y (A ))尾巴, 因此可用Oligo(dt)一纤维素亲和层析进行分离。Po ly A尾可与依附于各种支持基质上的Oligo(dt)形成稳定的RN A 一D N A 杂交链。先用高盐缓冲液稳定核酸杂交链, 当非多聚腺昔酸RN A 从基质中洗掉后再换用低盐缓冲液使双链结构去稳定化, 然后将Poly (A) + RN A 从树脂上洗脱下来。
      筛选Po ly (A)+RN A 通常有两种方法: Oligo(dt)柱层析和批量层析。柱层析一般用于哺乳动物细胞大量(> 25 ug)非放射性Po ly (A)+RN A的纯化。当哺乳动物细胞总RN A 量较少(< 50 ug)时常选择批量层析法。此法使用优级Oligo(dt)纤维素在其最适的结合和洗脱温度下实现m R N A 的分离纯化。它也适用于不管是否为放射性R N A 的大量样品的处理。

二、磁性颗粒

      市场上大多数商业核酸抽提试剂采用固相纯化法。相比于传统方法,固相抽提更快速和高效。它解决了许多液一液抽提存在的许多问题,如分离不完全等。固相系统抽提核酸依赖缓冲液的pH 值和盐浓度来吸附核酸, 其吸附过程基于以下原理:在离液条件下氢与亲水基质发生相互结合作用, 在水溶液中则通过阴离子交换柱发生离子交换, 以及通过亲和力和大小排除机制。
      磁珠分离技术是现今核酸纯化的一种简单高效的方法。带有磁荷的颗粒可通过磁场中的永磁将其移除。通常, 将带有固化亲和配基的磁载体或者与靶核酸有亲和力的预制生物聚合物用于分离步骤。这些磁颗粒可用不同的合成高分子、生物聚合物、多孔玻璃或者是基于无机磁物质(如表面修饰的氧化铁)的磁颗粒制成。表面积大的材料结合核酸的能力较强, 因此磁珠为分离支持物的较好选择。如果赋予容器侧壁磁性,样品混合物中结合有核酸的磁颗粒则聚集到容器壁, 直接倾倒容器可将其它物质去除。
      有一发明利用多聚物(如可磁化的纤维素)包裹磁性或顺磁性颗粒。在一定的盐浓度和聚亚烃基乙二醇存在条件下,磁化纤维素可结合核酸。小片段核酸需要在高盐浓度下才能与可磁化纤维素颗粒牢固结合。因此,可以根据核酸片段大小选择不同的盐浓度来释放结合在磁化纤维素上的核酸。用适当的漂洗缓冲液洗涤结合有核酸的磁化纤维素,再用合适的洗脱缓冲液将靶核酸与纤维素分离。在所有纯化步骤中,可利用磁场吸引磁化纤维素或将其吸引到管壁,使其与上清分离。该发明的磁化纤维素中含有高达90 % 的氧化铁。纤维素中磁性成分也可用其它磁性化合物如氧化亚铁或氧化镍代替。
      市场上有一种专门以磁力工具进行操作的抽提试剂盒,它不需要任何有机溶剂和反复离心、 真空抽滤或柱分离步骤,而是基于改良的碱裂解步骤和随后的核酸结合磁颗粒过程。磁力工具用于捕获结合有核酸的磁颗粒, 漂洗缓冲液可洗去杂质,洗脱缓冲液则可把核酸从磁性颗粒上洗脱下来。
      另有一种抽提试剂盒,它使用一个带保护盖的磁棒来捕获磁颗粒。磁棒伸人装有样品的容器吸引磁颗粒,然后放置到另一个容器中释放磁颗粒。它结合了硅胶柱纯化的快速高效和磁珠纯化的简便操作。
      用氧化锆珠纯化核酸是另一种类型的磁珠纯化。这些微球形的顺磁性珠具有较大的结合表面并且可以分散在溶液中, 这些特征使得核酸的结合、漂洗和洗脱都很彻底。总核酸抽提试剂盒就是运用该工艺进行核酸的纯化,利用含硫氰酸肌的溶液中的氧化锆珠对样品进行机械破碎, 不仅释放了核酸,也使样品基质中的核酸酶失活。样品裂解后,用异丙醇稀释样品;然后加人顺磁珠以结合核酸,磁珠和核酸的混合物被固定在磁体上;漂洗可除去蛋白质和其它杂质,再次漂洗则除去残留的结合溶液;最后核酸被低盐缓冲液洗脱基于固相可逆的固定化顺磁珠技术已被用于PC R 纯化系统来获取优质DNA 。它只有简单的流程, 无需离心和过滤。PCR 扩增子结合到顺磁颗粒后从溶液中被吸引出去,dNTP 、引物和盐类等杂质可被漂洗冲走。
      Oligo(dt)一磁珠是可从总RNA 样品中纯化pofy( A )+ RNA的Oligo(dt)基质中的一种。带有Poly A 尾的RNA 吸附到Oligo(dt)磁珠上, 然后磁珠被吸引到管底从而使mRNA 直接从总RN A 中分离。特殊处理的磁珠使其它核酸的非特异性结合降到最低,保证了mRNA 的纯度。
      三、自动化抽提系统
      自动化抽提系统是可高通量地处理样品、有助于简化分离步骤的一种大型、昂贵、复杂的仪器操作系统。自动化核酸提取过程的可能优点包括减少工作时间、降低人力成本、增加工作
者的安全性以及提高结果的可重复性和质量。
      在临床实验室, 需要从各种原材料中纯化出高质量的DNA、RNA等生物分子用于下游的检测应用。获取高质量和纯度的样品非常关键。因此, 开发自动化抽提系统不仅要有更快的抽提速度,还要有更高的一致性和重现性, 同时把交叉污染的风险降到最低。
      四、小结及展望
      核酸提取是下游操作和分析的前提, 高质量核酸的获取是下游过程成功进行的关键。从异硫氰酸胍一酚一氯仿抽提法到广泛使用的D N A 和RN A 柱分离技术, 从固相抽提法到自动化抽提系统,核酸抽提技术的不断改进使研究者对核酸研究和分析的效率大大提高, 使人们对地球上生物的理解越来越深刻。
      受当今自动化技术快速增长的影响, 自动化核酸抽提系统得以发展。核酸自动化抽提不仅节省工作时间,还降低了人力成本和工作者的安全隐患, 同时提高了结果的可重复性和质量。因此以自动化仪器代替人工将成为必然。但是,仪器的一些不足仍待不断改进。市场上的一些大型核酸抽提系统需具有专门技能的技术人员进行手工前处理, 采集到的临床标本常需特殊保存或者运送到实验室进行检测, 这些都提高了实际操作的难度。因此,核酸自动抽提应该实现真正的“离开式”自动化, 即完全自动化;大型仪器应该“瘦身”以便于移动,从而使标本能现场处理。可预期全自动抽提系统配以多效生物分子抽提方法和带有生物分子分析仪的便携式抽提系统或者它们之间的组合将成为核酸抽提技术未来发展的方向。