高考生物：一文理清抗体检测ELISA原理

心中u你

前几天，刚入职不久的邓师妹在微信上问殊老师关于单克隆抗体制备的一些问题。最近殊老师比较忙，本来打算敷衍敷衍了事。可邓师妹说请他喝奶茶，殊老师没抵抗住诱惑，最终还是回复了她。以下是殊老师和邓师妹的对话内容。

邓师妹：殊老师，单克隆抗体制备时，抗体检测具体怎么测呢？
殊老师：抗体检测的原理，你应该了解过了吧。
邓师妹：当然，抗原-抗体杂交嘛！
殊老师：那还有啥疑问！
邓师妹：我想问的是抗体检测时，加的检测试剂是抗原还是抗体。我看有说加抗体的，也有说加抗原的。
殊老师：这个问题，说起来有点复杂。抗体检测的方法有很多。常用的有免疫荧光法、蛋白质印迹、ELISA等，不同方法加的试剂多少有些不同。
邓师妹：啊，这么多！那高中阶段最常碰到的是哪种？我只想知道最常用的。
殊老师：那自然是ELISA。
邓师妹：ELISA？没听过。
殊老师：其实在题目中经常碰到，只是中学阶段较少出现这个名称。ELISA是enzyme linked immunosorbent assay的缩写，也叫酶联免疫吸附试验。听中文名是不是感觉有点熟悉。
邓师妹：中文名确实听着有点耳熟，看名字应该与酶、免疫有关？
殊老师：没错，酶是该实验过程需要加入的关键试剂，而免疫原理其实就是抗原-抗体杂交。
邓师妹：可这还是看不出加入的检测试剂是抗原还是抗体啊。
殊老师：先别急，总得弄清楚ELISA的原理吧。ELISA的类型有4种，分别是直接ELISA、间接ELISA、双抗夹心ELISA和竞争性ELISA。
邓师妹：这些都要了解吗？
殊老师：不用，高中题目中涉及较多的是间接ELISA和双抗夹心ELISA。不过既然你问到了，愿不愿意多学一点？
邓师妹：这......难道还能说不愿意？

1.直接ELISA（图1）
殊老师：那就先说直接ELISA吧，直接ELISA主要用于检测抗原。具体操作时，将待测抗原稀释一定倍数，然后加到一种叫酶标板的器材中，这种器材和细胞培养板很像，但不是同一种器材。经过一段时间，待测抗原会吸附在酶标板上。之后加入酶标一抗。
邓师妹：这个酶标一抗是什么？
殊老师：所谓酶标一抗，其实就是特定酶和抗体结合形成的复合物。其中抗体可以和待测抗原结合，酶可以催化反应。实验中最常用的酶是辣根过氧化物酶HRP，HRP可催化多种底物反应：如催化无色的TMB转化为蓝色产物。
邓师妹：哦，我明白了。颜色深浅和产物浓度成正比，产物的浓度和酶的浓度成正比，酶和抗体相连，抗体又和抗原结合，所以说颜色深浅和抗原的浓度成正比？
殊老师：真聪明，只是光看颜色深浅还不够准确，所以可以采用分光光度计测有色产物的吸光度，吸光度和产物浓度成正比。
邓师妹：对了，殊老师，您说直接ELISA主要用来检测抗原，那可以用来检测抗体吗？
殊老师：不能说绝对不行，但很少用，原因和抗体的结构有关。抗体的结构包括恒定区（Fc区，Y的下部）和可变区（Fab区，Y的两个叉子部分），Fab区可以和特定抗原结合，而Fc区具有种属特异性。也就是说同种生物的同一类抗体的Fc区基本是相同的。
邓师妹：这里的同一类抗体是什么意思？
殊老师：以人为例，人体内主要有IgA、IgE、IgG以及IgM四类抗体，这四类抗体的Fc区不同。而你我体内的IgG抗体，Fc区是基本相同的，但是你我和猪的Fc差别较大。
邓师妹：这和测抗体有什么关系呢？
殊老师：试想一下，你现在想用直接ELISA测你血清中的抗体，固定在酶标板上的是什么成分？
邓师妹：我血清中的抗体？
殊老师：没错，之后再加酶标一抗对吧！酶标抗体通常和抗体的Fc区结合，而你的血清中不光有待测抗体，还有别的抗体。酶标一抗也可以和这些抗体结合，从而干扰实验检测。



图1 直接ELISA原理

2.间接ELISA（图2）
殊老师：直接ELISA的操作步骤少，理论上来说出错概率小。但实际上它有很多缺点，最大的缺点是与待测抗原结合的为酶标一抗，数量太少，缺乏放大效应，一定时间生成的有色产物量太少，检测信号不强。
邓师妹：那间接ELISA能弥补这些不足吗？
殊老师：可以的，间接ELISA主要用来测抗体。通常先在酶标板上固定抗原，然后加入待测抗体，之后再加入酶标二抗及底物，此后的操作和直接ELISA是相同的。
邓师妹：间接ELISA涉及两种抗体，待测抗体和抗原结合，酶标二抗和待测抗体结合，都是特异性结合，怎么放大信号了？
殊老师：这同样和抗体的结构有关，待测抗体通常可以和2个甚至更多个酶标二抗结合，酶标二抗上可以结合多个酶分子，相当于两级放大，最终使相同时间内有色产物的量大大增加，检测信号自然更强。



图2 间接ELISA原理

3.双抗夹心ELISA（图3）
殊老师：接着说说双抗夹心ELISA，听名字你应该就能猜到加了两种抗体，将待测抗原夹在中间，因此是用来检测抗原的一种方法。
邓师妹：能用来检测抗体吗？
殊老师：跟前面一样，理论上不是不可以，但也很少用。这种检测的前提是两种已知抗体能和待测抗体的不同部位结合，但制备这两种抗体的难度太大，所以测抗体还不如用间接ELISA。
邓师妹：原来是这样，明白了。



图3 双抗夹心ELISA原理

4.竞争性ELISA（图4）
殊老师：竞争性ELISA是在酶标板上固定已知的抗原或抗体。以检测抗原为例：在酶标板固定特定的抗体，然后加入待测抗原和已知的酶标抗原，由于待测抗原和已知的酶标抗原都能和抗体结合，所以叫竞争性ELISA。
邓师妹：按照这个原理，最后显色的深浅和待测抗原浓度是呈反比吗？
殊老师：是的。
邓师妹：为什么不把酶标抗原换成能与待测抗原结合的酶标抗体呢？
殊老师：那就变成双抗夹心ELISA了。
邓师妹：我就是这个意思。
殊老师：当待测抗原浓度很低时，待测抗原很难和固相抗体结合，不如用竞争性ELISA检测的结果准确。
邓师妹：之前对抗体检测一直有疑惑，现在终于明白了。谢谢殊老师，为了表达我的谢意，我给您点杯奶茶？
殊老师：今天算了，最近体重飙升，要减肥了。说回正题，你把前三种ELISA的检测对象和加入的主要检测试剂归纳一下，加深印象。
邓师妹：OK，稍等。



图4 竞争性ELISA原理

十分钟后殊老师收到邓师妹发来的总结，也一并分享给大家，如下表：



表 三种ELISA的检测对象和加入的主要检测试剂

殊老师：现在考考你，抗体检测加的检测试剂是什么？
邓师妹：多数情况下，因为单克隆抗体的检测采用的是间接ELISA，所以加入的检测试剂既有抗原也有抗体？
殊老师：没错，看来你已经理解这几种ELISA的原理了。好了，今天就聊到这，早点休息。
邓师妹：好的，谢谢殊老师的耐心解答，等你不减肥了再请你喝奶茶！
殊老师：……

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